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muchong5577金虫 (正式写手)
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[交流]
引物快到了，PCR用什么酶比较好？
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| 请问大家，从放线菌基因组扩增几条800bp到1200bp、GC含量为70-75%的片段，用什么酶比较好？ |
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lwf991229(金币+1,VIP+0):辛苦~ 2-25 13:25
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10* Taqbuffer（Mg++ contained） 2.5uL DMSO 2uL dNTP(买来的浓度 我忘了 不要加多了） 2uL 模板 0.5uL或者更少 引物 1uL Taq 1uL 最后加 水 up to 25uL 我一般25uL P 发现和50 100一样 还省东西 很好 引物的处理： 你一般合成几个OD 1-2个足够 送来的先12000rpm离两分钟 然后加水溶比如35.5nmol 就加355uL水或TE 我一般用水 灭了分装冻-80没事的 然后溶了的Stock Solution冻-80 取一点稀释10倍 这样就是100mM稀释到10mM 这个浓度的在25或50ul体系中加入1uL 引物别加太多了 没用的 反而p不出来 你是Streptomyces？ 这个链霉菌就是这样 其他的Actenomyces也差不多 测序可能会有些问题 你在测序单上注明 高GC 70左右 他们会处理的 |
9楼2009-02-25 12:06:43
三磷酸腺苷
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lwf991229(金币+1,VIP+0):辛苦~ 2-23 21:46
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这个GC比有点高 如果你不愿意用比较贵的酶，那么可以用Promega的GoTaq配合添加DMSO来做，这个是入门级的方法，当然比较折腾。或许可以试试看不加DMSO，然后把变性提高到95℃，1min试试 还有一些扩增能力比较强的酶，一般不用DMSO，如Invitrogen的白金Taq，这个会稍微贵一点 另外也有一些日系的产品会有很多针对性的酶，比如KOD FX，广告是卖得挺好的，不知道实际如何，这个不算太贵 不推荐使用Takara的酶，保证折腾死你…… 如果不愁经费，那么用扩增能力强的酶，一次过做出来，不折腾 如果那个啥的话，经典的方法就是添加DMSO了，具体浓度需要自己摸 一般从2%加到15%左右，以1%为梯度摸 |
2楼2009-02-23 17:04:00
chemifunan
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4楼2009-02-23 18:50:34
chemifunan
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5楼2009-02-23 18:52:22