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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 基因过表达后WB 检测不到表达
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yida1520034

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因过表达后WB 检测不到表达 已有1人参与

研究的基因存在三个转录本，1.全长，2.外显子4缺失，外显子4、5缺失，分别将这三段基因序列用慢病毒包装后在肝癌细胞中过表达后提蛋白做WB，导入全长的基因WB 有条带，后两个序列导入之后检测不到条带。之前将三段基因用质粒做载体导入293T细胞做WB 都能检测到表达，但是转染肝癌细胞转染效率极低，所以换用慢病毒，按说慢病毒包装之后过表达应该更高才对，怎么会出现这样的情况？

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1楼 2017-11-09 00:00:19
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ywwabc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-11-12 22:40:58
慢病毒包装后转染时筛选稳转细胞不表达，还是仅仅转染几天就检测？可有带荧光看一下转染效率？转染多久？慢病毒转染很慢的，最好转96H以上！
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2楼2017-11-09 17:29:33
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qianwan1999

木虫 (小有名气)
(1)293细胞和肝癌细胞有区别，细胞内环境不一样;(2)不同片段的构象不同，有的构象容易被降解;(3)

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3楼2017-11-12 17:10:22
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yida1520034

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ywwabc at 2017-11-09 17:29:33
慢病毒包装后转染时筛选稳转细胞不表达，还是仅仅转染几天就检测？可有带荧光看一下转染效率？转染多久？慢病毒转染很慢的，最好转96H以上！

慢病毒带绿色荧光，稳筛之后几乎百分之百带荧光，稳转之后提RNA做qPCR有表达，提蛋白做的western blot没有条带

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4楼2017-11-13 20:22:26
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yida1520034

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qianwan1999 at 2017-11-12 17:10:22
(1)293细胞和肝癌细胞有区别，细胞内环境不一样;(2)不同片段的构象不同，有的构象容易被降解;(3)

现在转293T细胞western blot 也检测不到表达。想不明白什么原因

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5楼2017-11-13 20:23:55
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景致依然

新虫 (初入文坛)
请问你转293T细胞的效率多高，20%能做WB么

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6楼2018-07-30 09:09:44
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新星加油

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yida1520034 at 2017-11-13 20:23:55
现在转293T细胞western blot 也检测不到表达。想不明白什么原因
...

你好，请问当时这个问题解决了吗？怎么解决的呀？我现在mRNA 水平有表达，但是蛋白WB做不出来条带。比较崩溃。能否分享一下解决的过程呢，谢谢
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不只要一腔热血，一定要踏踏实实。戒掉各种懒惰及拖延症好吗
7楼2021-06-21 16:18:31
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