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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助各位大拿！！融合蛋白pcr程序设置！
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Rzazaza

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助各位大拿！！融合蛋白pcr程序设置！ 已有1人参与

大家好，我最近在做两个片段的基因融合的实验，第一个片段600多bp，第二个片段1400多bp,融合后目的片段2000多bp，并不算长，因为看文献里还有同学做到3、4千的都有……但是我怎么也融不上。两个片段分别pcr以后条带很亮，回收后条带也亮。但是融合了很多次都只有前一个片段的条带（引物用的是第一个片段的F和第二个片段的R）我怀疑是程序没有设计对，求各位大神帮忙！！！（我做过45到60的梯度pcr还是不行）

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1楼 2017-11-08 15:46:58
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
测一下两个片段浓度   先不加引物只加片段摩尔比一比一，五个循环后加引物再扩增25个循环

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2楼2017-11-08 19:58:20
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gastrodia

金虫 (正式写手)
融合序列使用连接肽CCCGGGCCCGGGCCCGGG（springer分子生物学系列丛书中哪一本我忘了，总之就是韩国老外的方法），往往出现这类问题是因为融合的片段两端引物存在错配和高级结构导致
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3楼2017-11-08 20:44:25
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
文献来源：Fusion PCR via Novel Overlap Sequences
Kamonchai Cha-aim , Hisashi Hoshida , Tomoaki Fukunaga ,
and Rinji Akada这里不能插图，我就不发了，你可以加联系我，我可以把文献发给你
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4楼2017-11-08 20:48:22
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筱小小晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by Rzazaza at 2017-11-08 15:46:58
大家好，我最近在做两个片段的基因融合的实验，第一个片段600多bp，第二个片段1400多bp,融合后目的片段2000多bp，并不算长，因为看文献里还有同学做到3、4千的都有……但是我怎么也融不上。两个片段分别pcr以后条带 ...

现在扩出来了吗，我也有同样的问题，一个1200bp，一个1700bp。融合后就是扩不出来

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5楼2018-01-25 15:02:52
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domopal

铁杆木虫 (正式写手)
加大片段模板的量，提高不加引物循环阶段的退火温度

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贞
6楼2018-02-25 00:10:51
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坏坏女王

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gastrodia at 2017-11-08 20:44:25
融合序列使用连接肽CCCGGGCCCGGGCCCGGG（springer分子生物学系列丛书中哪一本我忘了，总之就是韩国老外的方法），往往出现这类问题是因为融合的片段两端引物存在错配和高级结构导致

您好，这个连接肽是什么？怎么应用？出现了和楼主一样的问题，求大神指点
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7楼2018-04-02 09:41:43
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gastrodia

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 坏坏女王 at 2018-04-02 09:41:43
您好，这个连接肽是什么？怎么应用？出现了和楼主一样的问题，求大神指点...

这个连接肽就是韩国佬自己设计的，因为GC含量高，更容易匹配。
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8楼2018-04-02 17:13:54
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