[交流] 求助，PCR电泳拖尾很厉害 已有2人参与

各位大神好，本人菜鸟一枚，最近做琼脂电泳严重拖尾，多次更改条件均难以解决。        本人现在目的基因片段是244bp，引物二聚体是40bp，用的DNA Marker为DL 500，最亮条带是200bp，其余分别为50、100、150、300、400、500 bp，用的是宝生物、捷瑞公司的PCR MIX，反应条件、反应体系如下： 人基因组模板DNA：50-200bp 引物终浓度：0.2-0.8uM PCR MIX：12.5/15ul H2O：补充至25ul 1、94    预热  5min 2、94    30/45s 3、55/58/60   30/45s 4、72   30/45s 5、72   10min 2-4  30循环 PS：现PCR多为模板DNA 100bp，引物终浓度 0.8uM，宝生物公司PCR MIX 15ul，PCR反应条件：2-4步 时间 45s。     10月21日电泳是拖尾比较厉害，但还能看到目的条带（图一），但近几日出现相同条件下无法复制之前的PCR条带，出现明显拖尾，更改条件也是如此，图二、图三是同一次电泳，不同时间下所见条带（图三最右为后加样品），电泳为自上而下，加样均为3ul，核酸燃料为goldview 2。     我已经做过模板（50-200bp）、引物浓度（0.2-0.8uM）、退火温度梯度（55/58/60），结果都不好，电泳槽长度大约为18-19cm，我用的是80-90V电压，模板DNA单独电泳时只有一条条带，亮度尚可。    现在考虑，是否存在模板DNA污染，亦或是是否PCR MIX过多，12.5ul足够，或是PCR反应条件存在缺陷。也无法区分究竟是拖尾还是非特异性扩增，**各位大神指点    表述不清，敬请海涵。 图一.jpg 图二.jpg 图三.jpg

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