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倪小哈

新虫 (初入文坛)

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虫号: 5323065
注册: 2016-12-06
专业: 生物物理、生物化学与分子

[求助] 连接转化总失败已有1人参与

目的片段用含有酶切位点的全长引物pcr之后酶切，载体也用相同的酶进行酶切，连接然后转化，但是转化一直不成功，不知道问题出在哪里，感受态一定是好使的，目的片段和载体的酶切回收产物也比较亮，就是连不上，连接酶用的solution1，求帮助指点一下问题出在哪里，跪谢！

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1楼 2017-10-19 10:26:52

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18287718557

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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注册: 2016-11-30
专业: 肿瘤学

我的也出现这种状况

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2楼2017-10-19 11:07:20

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damaoouba

木虫 (正式写手)

应助: 17 (小学生)
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性别: MM
专业: 植物生理与生化

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

是连接不上还是转化不进感受态啊？？？这两个问题您都说了是都遇到了吗？
目的片段和载体酶切回收之后测一下浓度，连接时候3:1的含量连接。
转化这种问题我也遇到过，连接测序都无误之后就是没法转到农杆菌感受态里，别的基因可以，我这个不行，目的片段换载体连接再转化也不姓，换了别人帮做也不行。最终是换了一种感受态就行了。。。。。最终也不知道之前失败原因是啥，建议楼主不要纠结原因，换一下载体试试，不行再换一下感受态试试。

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3楼2017-10-19 11:26:23

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