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风铃。新虫 (初入文坛)
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TA克隆和TOPO克隆和Gateway克隆原理他们之间不同点... 已有1人参与
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TA克隆和TOPO克隆和Gateway克隆原理他们之间不同点有哪些？谢谢啦 @youlinglyw 发自小木虫Android客户端 |
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晋鹏
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【答案】应助回帖
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Gateway®克隆技术的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应，一种准确保存遗传信息的有效的自然的生化途径。与传统的需要DNA限制性内切酶、DNA连接酶、凝胶电泳和DNA片段纯化等多个步骤的单调乏味的亚克隆方法相比，该方法只需一步生化反应而且操作方便、快捷(室温60分钟)，节省了大量的时间和劳力。另外，根据目的蛋白的生产和纯化的不同要求， Invitrogen公司提供一系列含有不同启动子和融合标签、以及在几种宿主表达的目标载体。 TA克隆技术（TA cloning）利用Taq聚合酶具有末端转移酶（TdT）活性，但却不具有3'-5'端外切酶校准活性的特点，可在PCR产物的3'端加上一个非模板依赖碱基“A”。pMD18-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在Xba I和Sal I识别位点间插入一个EcoR V位点，然后用EcoR V进行酶切使质粒线性化，并在它的3'端添加“T”构建而成。因其3'端带有一个突出的“T”尾，能高效地与带“A”尾的PCR产物连接，极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法。 TOPO克隆的核心是DNA拓扑异构酶I，它同时扮演了限制性内切酶和连接酶两个角色。它的生物功能是在复制过程中切断并重新连接DNA。牛痘病毒拓扑异构酶I特异性地识别5’-(C/T)CCTT-3’序列，与3’T的磷酸基团形成共价键，并切断一条DNA链，使DNA解链。随后它从DNA末端撤离。为了利用拓扑异构酶的连接活性，TOPO载体被线性化，并在每个3’磷酸基团上连接了拓扑异构酶I。基本过程与TA克隆相似，注意事项可以参考TA克隆的策略。唯一不同的是连接过程。 |
2楼2017-10-13 08:31:28