24小时热门版块排行榜    

查看: 456  |  回复: 6
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

wdy0330

铜虫 (初入文坛)

[交流] 低丰度基因克隆求助

各位高手大家好,本人现预克隆一在其他物种中保守性非常强的基因,且能保证在我提取RNA的物种中存在该基因,克隆策略为提取总RNA,反转录后采用兼并引物进行克隆,但该基因丰度很低,经多次尝试均未PCR出该基因的片段,为此向各位请教针对低丰度基因克隆,有什么策略?在该基因克隆试验中应该注意什么事项,即哪地方容易出现问题??

多谢指点!
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
哈哈  好久没来看此贴了,如今已经拿下! [/quote]


楼主是如何拿下的,可以分享下吧
7楼2009-07-11 16:04:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

一个是提高RNA的得率,而不要太在乎那个纯度,得率和纯度往往就是一对矛盾
第二,用上好一点的试剂
比如逆转录酶用SuperScipt III(这家伙是目前世界上最好的逆转录酶了,当然也很贵)
PCR的时候也用扩增能力强的酶(至少不要比Promega的GoTaq差吧)
酶是很重要的一环,其余的条件优化都只是治标不治本
3楼2009-02-18 09:53:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wdy0330

铜虫 (初入文坛)

回复2楼

针对上下游片段均已知的片段来说克隆目的片段,nested pcr 不失为一种好的策略,但我所克隆的基因只能从RNA水平出发且仅是根据其他物种的保守序列来设计的简并引物扩增,nested pcr 会不会难度更大?
4楼2009-02-20 15:45:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)

好好设计简并引物(引物的简并性不能太高)
还是有希望的
5楼2009-02-20 15:54:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-24 3/150 2026-03-24 21:31 by peike
[考研] 求调剂,一志愿:南京航空航天大学大学 ,080500材料科学与工程学硕,总分289分 +5 @taotao 2026-03-19 5/250 2026-03-24 21:07 by greychen00
[考研] 0854电子信息求调剂 +6 α____ 2026-03-22 7/350 2026-03-24 19:46 by sunjie8888
[考研] 274求调剂 +5 顾九笙要谦虚 2026-03-24 5/250 2026-03-24 18:43 by jhhcooi
[考研] 299求调剂 +7 某某某某位 2026-03-21 7/350 2026-03-24 15:24 by cuifj
[考研] 307求调剂 +3 余意卿 2026-03-21 6/300 2026-03-24 15:03 by 余意卿
[考研] 材料与化工328分调剂 +4 。,。,。,。i 2026-03-23 4/200 2026-03-24 11:03 by 544594351
[考研] 276求调剂。有半年电池和半年高分子实习经历 +9 材料学257求调剂 2026-03-23 10/500 2026-03-24 07:36 by wangy0907
[考研] 284求调剂 +10 Zhao anqi 2026-03-22 10/500 2026-03-24 00:08 by Equinoxhua
[考研] 求调剂 +7 十三加油 2026-03-21 7/350 2026-03-23 23:48 by 热情沙漠
[考研] 341求调剂(一志愿湖南大学070300) +5 番茄头--- 2026-03-22 6/300 2026-03-23 23:45 by Txy@872106
[考研] 一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂 +7 vv迷 2026-03-22 7/350 2026-03-23 23:44 by Txy@872106
[考研] 361求调剂 +3 Glack 2026-03-22 3/150 2026-03-23 22:03 by fuyu_
[考研] 求调剂材料学硕080500,总分289分 5+3 @taotao 2026-03-19 21/1050 2026-03-23 10:17 by 冠c哥
[考研] 289材料与化工(085600)B区求调剂 +3 这么名字咋样 2026-03-22 4/200 2026-03-22 17:56 by 云民大李老师
[考研] 一志愿中南化学(0703)总分337求调剂 +9 niko- 2026-03-19 10/500 2026-03-22 16:08 by ColorlessPI
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
[考研] 22 350 本科985求调剂,求老登收留 +3 李轶男003 2026-03-20 3/150 2026-03-21 13:28 by 搏击518
[考研] 085600材料与化工调剂 324分 +10 llllkkkhh 2026-03-18 12/600 2026-03-19 14:33 by llllkkkhh
信息提示
请填处理意见