24小时热门版块排行榜    

查看: 587  |  回复: 6
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

wdy0330

铜虫 (初入文坛)

[交流] 低丰度基因克隆求助

各位高手大家好,本人现预克隆一在其他物种中保守性非常强的基因,且能保证在我提取RNA的物种中存在该基因,克隆策略为提取总RNA,反转录后采用兼并引物进行克隆,但该基因丰度很低,经多次尝试均未PCR出该基因的片段,为此向各位请教针对低丰度基因克隆,有什么策略?在该基因克隆试验中应该注意什么事项,即哪地方容易出现问题??

多谢指点!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

一个是提高RNA的得率,而不要太在乎那个纯度,得率和纯度往往就是一对矛盾
第二,用上好一点的试剂
比如逆转录酶用SuperScipt III(这家伙是目前世界上最好的逆转录酶了,当然也很贵)
PCR的时候也用扩增能力强的酶(至少不要比Promega的GoTaq差吧)
酶是很重要的一环,其余的条件优化都只是治标不治本
3楼2009-02-18 09:53:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

wdy0330

铜虫 (初入文坛)

回复2楼

针对上下游片段均已知的片段来说克隆目的片段,nested pcr 不失为一种好的策略,但我所克隆的基因只能从RNA水平出发且仅是根据其他物种的保守序列来设计的简并引物扩增,nested pcr 会不会难度更大?
4楼2009-02-20 15:45:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)

好好设计简并引物(引物的简并性不能太高)
还是有希望的
5楼2009-02-20 15:54:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wdy0330

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2009-2-20 15:54:
好好设计简并引物(引物的简并性不能太高)
还是有希望的

哈哈  好久没来看此贴了,如今已经拿下!
6楼2009-07-11 15:00:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 岩土工程学报什么时候才能终审完呐 25+3 yeager111 2026-08-10 4/200 2026-08-16 20:42 by tfang
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +11 家与远方 2026-08-10 16/800 2026-08-16 10:28 by ray43
[基金申请] 有时候,自然基金真的不能太认真 (我的申报经验) +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥? +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 重要来源:本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见,大家看看几个A,几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
信息提示
请填处理意见