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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 低丰度基因克隆求助
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wdy0330

铜虫 (初入文坛)

[交流] 低丰度基因克隆求助

各位高手大家好，本人现预克隆一在其他物种中保守性非常强的基因，且能保证在我提取RNA的物种中存在该基因，克隆策略为提取总RNA，反转录后采用兼并引物进行克隆，但该基因丰度很低，经多次尝试均未PCR出该基因的片段，为此向各位请教针对低丰度基因克隆，有什么策略？在该基因克隆试验中应该注意什么事项，即哪地方容易出现问题？？

多谢指点！
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1楼 2009-02-18 09:32:48
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wdy0330

铜虫 (初入文坛)

回复2楼

针对上下游片段均已知的片段来说克隆目的片段，nested pcr 不失为一种好的策略，但我所克隆的基因只能从RNA水平出发且仅是根据其他物种的保守序列来设计的简并引物扩增，nested pcr 会不会难度更大？
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4楼2009-02-20 15:45:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
一个是提高RNA的得率，而不要太在乎那个纯度，得率和纯度往往就是一对矛盾
第二，用上好一点的试剂
比如逆转录酶用SuperScipt III（这家伙是目前世界上最好的逆转录酶了，当然也很贵）
PCR的时候也用扩增能力强的酶（至少不要比Promega的GoTaq差吧）
酶是很重要的一环，其余的条件优化都只是治标不治本
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3楼2009-02-18 09:53:54
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
好好设计简并引物(引物的简并性不能太高)
还是有希望的
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5楼2009-02-20 15:54:13
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wdy0330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2009-2-20 15:54:
好好设计简并引物(引物的简并性不能太高)
还是有希望的

哈哈  好久没来看此贴了，如今已经拿下！
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6楼2009-07-11 15:00:50
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