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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » RT-PCR 实验寻求高手指点
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zwq0621

银虫 (小有名气)

[交流] RT-PCR 实验寻求高手指点

最近反转录老是没有，寻求高手指导啊！
附件文件是从样品RNA提取后DNA酶处理之后电泳的结果
从左往右，分别是Marker，前两个为处理前样品，后两个为处理之后的样品，处理之后浓度大概在300ng/ul的样子
反转录用的是promega 的M-MLV，用10ul体系用了5ul 的RNA，具体操作步骤如下：
模板RNA                              5 ul（相当于1.5ug）
Random Primers（9-mer,250 μM）      0.6 ul（相当于450ng, 300ng/ug RNA）
DEPC水                              1.3 ul
70℃保温5分钟，后迅速在冰上放置2分钟以上。短暂离心溶液聚集于Microtube管底部。
在上述Microtube管中按次序加入下列反转录反应液，反转录用的是promega 的M-MLV酶：
5×M-MLV Buffer                      2 μl
dNTP Mixture（各10 mM）            0.5 μl
RNase Inhibitor（40 U/μl）            0.25 μl（购自Takara产品）
RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/μl）  0.4ul （相当于80u）
用枪上下吹吸轻混匀，37℃保温1小时。
70℃保温15分钟后冰上冷却备用。
得到的cDNA溶液直接用于PCR扩增，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用0.5ul/20ul体系。
dH2O        15.1μl
10*PCR Buffer        2 ul
dNTP Mixture（各2.5 mM）         1.6μl
Forward Primer（20 μΜ）         0.3μl
Reverse Primer（20 μΜ）         0.3μl
TaKaRa rTaq®（5 U/μl）        0.25 μl
cDNA溶液        0.5μl
Total Volume         20 μl

结果：连作为对照的基因（保守而丰富的16s）也没有扩到，只有DNA模板扩增能扩到，说明第二步扩增没有问题吧，那问题应该是处在第一步的反转录上面，问题到底出在哪里呢？RNA量不够吗？说明书上就是用的2ugRNA/25ul体系的啊，请求有经验的高手帮帮忙啊！！

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-19 at 12:37 ]
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1楼 2009-02-17 11:48:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论，欢迎常来~ 2-18 10:00
保守而丰富的16s-------你的细胞是原核的？
Random Primers（9-mer,250 μM）-----尝试用基因特异的引物

另外……不要用takara的酶，扩增能力实在一般
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2楼2009-02-17 13:08:18
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论，欢迎常来~ 2-18 10:00
应该是RNA的问题，纯度和浓度都不够，图片显示RNA都有降解了，而且感觉浓度不高
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会当凌绝顶，一览众山小
3楼2009-02-18 00:37:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
其实这个RNA是可以做实验的，相信我，更糟的降解我都能做出来
更低的浓度（很少的细胞提的）也做出来过
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4楼2009-02-18 09:49:01
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zwq0621

银虫 (小有名气)
三磷酸腺苷   你好!
真的吗?你用的什么转录酶,M-MLV(promega)的是不是可以，还是说需要高活性的酶？能否告知你做的详细Protocol, 我做RNA 是新手，实验室又没有做这个的，所以苦闷了好长时间，不知道问题出在哪里，试了一遍又一遍，还是出不来
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5楼2009-02-18 10:10:57
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
啊，已经站内信给你了
protocol就是说明书，不用再改呢
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6楼2009-02-18 10:15:09
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十一月

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-2-18 09:49:
其实这个RNA是可以做实验的，相信我，更糟的降解我都能做出来
更低的浓度（很少的细胞提的）也做出来过

你对科研态度太不严谨了。谁能相信你的结果呢，既然RNA都已经降解了，这样的试验结果可信度高吗？ 别在这里害人了。
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7楼2009-02-18 10:30:55
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十一月

银虫 (正式写手)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-31 14:37
LZ，你跑RNA是变型胶还是非变性胶？你的RNA提得的确很一般。如果你用来做参照的基因都跑不出来，显然是你前面RNA的问题。如果你参照基因可以跑出来，目的带出不来也是有可能的，比如说本身基因的表达丰度非常低呢。慢慢摸索吧，很多试验不是一次就能够做成功的，很多反应的体系需要不断地优化。祝你成功。
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8楼2009-02-18 10:34:05
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zwq0621

银虫 (小有名气)
RNA我跑的是一般的琼脂糖电泳胶，只是新胶和新buffer而已
我需要扩得片段相对很短，最长的是对照基因16s长度为500bp左右，我的目的基因片段大约都在500bp以下，我只是想看一下我的目的基因是否表达，就是实验摸索的时间太长了，估计现在放在-80度的RNA可能都会有不同程度的降解了，一直都扩不出来不知道问题出在哪，我用trizol把发酵液中的RNA提取出来之后就放到-80度保存，每次取30~50ul出来进行去除DNA处理，处理之后有一定的损失，溶解到10ul左右，浓度类似上面的电泳图，然后就是取5ul进行反转录，一直都是出不来，我以为是第二步PCR加的模板cDNA量比较少，昨天我将模板加大到2ul和4ul（相应减少PCR过程中的dNTP的用量），我是将两套引物都加到一个反应体系中的（对照引物和目的基因的引物），但是还是没有出来。

[ Last edited by zwq0621 on 2009-2-18 at 10:54 ]
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9楼2009-02-18 10:53:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by 十一月 at 2009/2/18, 10:30:



你对科研态度太不严谨了。谁能相信你的结果呢，既然RNA都已经降解了，这样的试验结果可信度高吗？ 别在这里害人了。

谁提的RNA能保证一点都不降解呢？
只要我的目的RNA没有被降解完就好了吧
只要有一点点不久能做出来不是吗？
又不是做芯片，普通的RT-PCR就算有降解那又如何呢？
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10楼2009-02-18 10:57:40
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