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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » RT-PCR 实验寻求高手指点
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十一月

银虫 (正式写手)
你在实验操作上尚欠规范：1、RNA放在-80度关键看你是保存在什么溶液中。如DEPC水、如无水乙醇等，等。有些保存方法对后续的反应有影响。2、你把RNA从-80度冰箱取出来，再放进去，如此反复冻融，肯定会影响RNA的质量。3、你溶解RNA的溶剂实在太多，因为从你的描述中可以推断出来的：每次取30-50微升。这样，你的RNA溶液原始浓度肯定很低，这也难怪你跑的RNA带非常淡。4、如果你确信RNA和反转录是没有问题的，那么你的PCR体系是不是有问题。如引物设计，退火温度等等。试验每一个步骤都需要细心推敲，尤其当你对这块还不熟悉的时候，更加需要注意，不要偷懒，按照标准的方法去做，如RNA你就用甲醛变性胶去跑，你每一步都过关的话，就容易找问题，像你现在这样貌似很多步骤都有问题，很难找原因的。所以，我们经常说做试验要严谨，要扎扎实实地一步一个脚印走，不要偷眼。最后祝你成功。
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11楼2009-02-18 11:03:02
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
==b
另外，石蜡片的RNA早就在制片和保存的过程中自发降解了n多RNA
但是照样可以做实验，就算是northern都能做
所以不存在降解严重就不可以做实验的问题，只需要有良好的对照组

还有，鉴定稳定株一类的只有很少的细胞（谁等它长满啊，那得等到什么时候）
所以RNA的浓度就算很低也能做出来

我还甚至逆转录过病毒的RNA，那个病毒不是扩大培养过的，只有很少量，是感染细胞24h后抽细胞里面的RNA再逆转录，同样也一次成功做出来并通过测序验证，和ncbi的一模一样

“害不害人”关键看你见识的多寡，信就信不信拉倒
质控固然重要，但按你这么说石蜡片做出来的结果都是不可信的了，呵呵
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12楼2009-02-18 11:05:49
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zwq0621

银虫 (小有名气)
非常感谢大家就我的问题的讨论!
可能我对我的问题描述的还是不清楚
"1、RNA放在-80度关键看你是保存在什么溶液中。如DEPC水、如无水乙醇等，等。有些保存方法对后续的反应有影响。"
我要做的是不同菌株的RT,所以在去年年底的时候我提了很多菌株的RNA,每个菌株我每次提两管备用,每管采用的都是3ml发酵液菌体,提取出来后存储在DEPC水里面,每管50ul,同一个菌株的两管应该是差不多的浓度.取30ul的话,两次一管就用完了,取50ul的话一次就用一管,所以有些菌株由于摸条件已经没有RNA了,需要重新再提,但是因为不知道问题出在哪,所以我就换前期提好的别的菌株再做,等找到原因了再去新提取RNA.
所以应该不是您说的溶解在大体积里然后反复冻融取样的问题吧.

"4、如果你确信RNA和反转录是没有问题的，那么你的PCR体系是不是有问题。如引物设计，退火温度等等。试验每一个步骤都需要细心推敲，尤其当你对这块还不熟悉的时候，更加需要注意"
我在做PCR的时候会用DNA作为阳性对照同时来做,每次在DNA里面都能够扩增到对照基因和目的基因,但是反转录样本里面就扩不出来,我想这应该不是引物设计和退火温度问题吧
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13楼2009-02-18 11:36:37
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
这样子的，楼主能不能新鲜提RNA再试试，虽然说，保存几个月也没问题的
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14楼2009-02-18 12:52:34
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