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zwq0621

银虫 (小有名气)

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[交流] RT-PCR 实验寻求高手指点

最近反转录老是没有，寻求高手指导啊！
附件文件是从样品RNA提取后DNA酶处理之后电泳的结果
从左往右，分别是Marker，前两个为处理前样品，后两个为处理之后的样品，处理之后浓度大概在300ng/ul的样子
反转录用的是promega 的M-MLV，用10ul体系用了5ul 的RNA，具体操作步骤如下：
模板RNA                            5 ul（相当于1.5ug）
Random Primers（9-mer,250 μM）    0.6 ul（相当于450ng, 300ng/ug RNA）
DEPC水                            1.3 ul
70℃保温5分钟，后迅速在冰上放置2分钟以上。短暂离心溶液聚集于Microtube管底部。
在上述Microtube管中按次序加入下列反转录反应液，反转录用的是promega 的M-MLV酶：
5×M-MLV Buffer                   2 μl
dNTP Mixture（各10 mM）          0.5 μl
RNase Inhibitor（40 U/μl）          0.25 μl（购自Takara产品）
RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/μl）  0.4ul （相当于80u）
用枪上下吹吸轻混匀，37℃保温1小时。
70℃保温15分钟后冰上冷却备用。
得到的cDNA溶液直接用于PCR扩增，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用0.5ul/20ul体系。
dH2O 15.1μl
10*PCR Buffer 2 ul
dNTP Mixture（各2.5 mM） 1.6μl
Forward Primer（20 μΜ） 0.3μl
Reverse Primer（20 μΜ） 0.3μl
TaKaRa rTaq®（5 U/μl） 0.25 μl
cDNA溶液 0.5μl
Total Volume 20 μl

结果：连作为对照的基因（保守而丰富的16s）也没有扩到，只有DNA模板扩增能扩到，说明第二步扩增没有问题吧，那问题应该是处在第一步的反转录上面，问题到底出在哪里呢？RNA量不够吗？说明书上就是用的2ugRNA/25ul体系的啊，请求有经验的高手帮帮忙啊！！

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-19 at 12:37 ]

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1楼 2009-02-17 11:48:32

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zwq0621

银虫 (小有名气)

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RNA我跑的是一般的琼脂糖电泳胶，只是新胶和新buffer而已
我需要扩得片段相对很短，最长的是对照基因16s长度为500bp左右，我的目的基因片段大约都在500bp以下，我只是想看一下我的目的基因是否表达，就是实验摸索的时间太长了，估计现在放在-80度的RNA可能都会有不同程度的降解了，一直都扩不出来不知道问题出在哪，我用trizol把发酵液中的RNA提取出来之后就放到-80度保存，每次取30~50ul出来进行去除DNA处理，处理之后有一定的损失，溶解到10ul左右，浓度类似上面的电泳图，然后就是取5ul进行反转录，一直都是出不来，我以为是第二步PCR加的模板cDNA量比较少，昨天我将模板加大到2ul和4ul（相应减少PCR过程中的dNTP的用量），我是将两套引物都加到一个反应体系中的（对照引物和目的基因的引物），但是还是没有出来。

[ Last edited by zwq0621 on 2009-2-18 at 10:54 ]