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落日余晖34木虫 (正式写手)
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脱靶还是未发生剪切？ 已有3人参与
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楼主采用crispr/cas9双质粒系统对克雷伯氏菌进行敲除，这两个质粒均已证明可以在大肠mg1655中进行基因敲除，但是我设计好4个sgRNA，进行敲除时发现，我成功将两个质粒都转入了，而板上全是假阳性菌落，猜测原因可能是cas9未成功表达，其启动子为本源启动子，而sgrna的启动子是pj23119，是一种合成的细菌组成型启动子，另外，关于脱靶我很困惑，脱靶应该是指发生了非特异性剪切，而我转完含有sgrna的质粒之后，后培养菌体取的很少涂板也能糊板，说明应该是没有发生剪切，因为剪切了的话，一部分没来的及修复的细胞应该是致死的。还望各位小伙伴给分析一下，为什么会有这么高的假阳性。 发自小木虫Android客户端 |
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lusandanooo
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我遇到了跟你一样的问题，敲的是革兰氏阴性菌，非大肠，已经试了8个sgRNA，每次转化都能长几百个单克隆，但全是假阳性…… 发自小木虫Android客户端 |
2楼2018-01-05 22:24:13
3楼2018-01-16 14:57:22
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4楼2019-04-17 11:06:26