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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 请教大家，针对假单胞菌,蜡样芽孢杆菌以及志贺氏菌特异基因扩增不出来，求赐教！
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jinqianghu

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教大家，针对假单胞菌,蜡样芽孢杆菌以及志贺氏菌特异基因扩增不出来，求赐教！ 已有2人参与

请教各位同仁，针对假单胞菌基因PEA基因，蜡样芽孢杆菌cytK基因、志贺氏菌ipaH基因扩增不出来，咋回事？
我是利用细菌的纯培养，然后用公司试剂盒抽提细菌基因组，接着作传统的PCR，引物长度23bp，30bp都尝试过，就是出不来阳性结果，请大家帮忙分析以下原因，究竟是哪一步出了问题？是抽提基因组出了问题？还是PCR引物出了问题？抑或是别的原因，求赐教！
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jinqianghu

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1楼 2017-09-21 17:22:22
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liuhaolin3

至尊木虫 (著名写手)
你的实验有阳性对照吗？

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2楼2017-09-21 19:49:24
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物太长，
IpaH-F1        TGGAAAAACTCAGTGCCTCT
IpaH-R1        CCAGTCCGTAAATTCATTCT
这个验证过了，可以用。浙大 文献里面的
用我的试试，另外一个我没有。。。
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3楼2017-09-22 08:35:18
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jinqianghu

铜虫 (小有名气)
谢谢同行的答复，liuhaolin3@我没有做阳性对照；snoopytbw@，我用你的引物分析了一下，你给的引物扩增产物大小大概是423bp，我想把ipaH全长阅读框1599全部PCR出来。不知道现在怎么办？
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4楼2017-09-22 09:47:16
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mhhhwcf059

新虫 (著名写手)
帮你顶，人还是厚道点好
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5楼2017-09-22 12:28:10
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liuhaolin3

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
snoopytbw: 金币+2, 略有帮助 2017-09-27 15:53:22
引用回帖:
4楼: Originally posted by jinqianghu at 2017-09-22 09:47:16
谢谢同行的答复，liuhaolin3@我没有做阳性对照；snoopytbw@，我用你的引物分析了一下，你给的引物扩增产物大小大概是423bp，我想把ipaH全长阅读框1599全部PCR出来。不知道现在怎么办？

最好能做个阳性对照，这样样品在PCR没条带的情况下，可以排除是体系和引物的问题

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6楼2017-09-22 12:50:11
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jinqianghu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-09-22 08:35:18
引物太长，
IpaH-F1        TGGAAAAACTCAGTGCCTCT
IpaH-R1        CCAGTCCGTAAATTCATTCT
这个验证过了，可以用。浙大 文献里面的
用我的试试，另外一个我没有。。。

你给的这个引物长度是20bp,我自己设计的23bp与30bp都出不来.你说我的引物太长,我觉得也可能是这方面的原因,能否把引物长度降低到15bp-18bp之间?
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7楼2017-09-27 10:41:18
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by jinqianghu at 2017-09-22 09:47:16
谢谢同行的答复，liuhaolin3@我没有做阳性对照；snoopytbw@，我用你的引物分析了一下，你给的引物扩增产物大小大概是423bp，我想把ipaH全长阅读框1599全部PCR出来。不知道现在怎么办？

全扩的话，可以这样，你设计引物为ORF最两端的序列，然后PCR产物直接做克隆去测序就好了，这样比较简单，否则很难测全长
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8楼2017-09-27 15:54:37
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jinqianghu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-09-27 15:54:37
全扩的话，可以这样，你设计引物为ORF最两端的序列，然后PCR产物直接做克隆去测序就好了，这样比较简单，否则很难测全长...

现在关键的问题,我设计的引物得不到PCR产物,跑电泳啥也没有,不知道问题究竟出在哪里?
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9楼2017-09-27 16:52:22
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jinqianghu at 2017-09-27 16:52:22
现在关键的问题,我设计的引物得不到PCR产物,跑电泳啥也没有,不知道问题究竟出在哪里?...

把序列和引物，站内给我看看呢
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10楼2017-09-28 08:50:48
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