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一颗行走的树

新虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白纯化 已有3人参与

现在在做蛋白纯化，有一个蛋白FDH用50mM的咪唑就能洗脱下来，但是条带不单一，有什么方法可以让条带变得单一吗？求大神赐教

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1楼 2017-08-31 08:33:08
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zixinzuiyue

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换纯化方法，镍柱本来就是用来初级纯化的

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2楼2017-08-31 18:57:50
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梦想与理想

银虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-06 07:42:45
可以尝试不同填料方法精纯一下，譬如Capto SP ImpRes、Capto adhere等等填料精纯下，一步纯化很难得到比较纯的蛋白，希望对你有帮助。
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相信自己
3楼2017-09-01 10:33:07
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一颗行走的树

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zixinzuiyue at 2017-08-31 18:57:50
换纯化方法，镍柱本来就是用来初级纯化的

我换了离子交换柱，也没有纯化出来呢～而且这个蛋白的表达量也不高，我想下一步换个质粒试一下，不知道这种方法可不可行？

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4楼2017-09-03 07:28:48
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一颗行走的树

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by 梦想与理想 at 2017-09-01 10:33:07
可以尝试不同填料方法精纯一下，譬如Capto SP ImpRes、Capto adhere等等填料精纯下，一步纯化很难得到比较纯的蛋白，希望对你有帮助。

谢谢，虽然我都不懂你说的这些填料大神，你可以告诉我一下阴离子交换柱使用的基本流程吗？

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5楼2017-09-03 07:30:50
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梦想与理想

银虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-06 07:43:05
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5楼: Originally posted by 一颗行走的树 at 2017-09-03 07:30:50
谢谢，虽然我都不懂你说的这些填料大神，你可以告诉我一下阴离子交换柱使用的基本流程吗？
...

一般而言，阴离子交换柱分为强阴离子和弱阴离子，强阴离子有Q，弱的有DEAE，你可以调节pH在等电点之上，弱盐溶液平衡柱子，上样，强盐溶液洗脱，收集峰，然后不同段峰跑电泳，看看结果。
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6楼2017-09-04 11:19:53
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一颗行走的树

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by 梦想与理想 at 2017-09-04 11:19:53
一般而言，阴离子交换柱分为强阴离子和弱阴离子，强阴离子有Q，弱的有DEAE，你可以调节pH在等电点之上，弱盐溶液平衡柱子，上样，强盐溶液洗脱，收集峰，然后不同段峰跑电泳，看看结果。...

嗯嗯，谢谢，我想问，蛋白的等电点是怎么确定的啊？

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7楼2017-09-05 21:52:45
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18291126208

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by 一颗行走的树 at 2017-09-05 21:52:45
嗯嗯，谢谢，我想问，蛋白的等电点是怎么确定的啊？
...

有很多在线计算的网站， 你输入蛋白序列，会计算出你的蛋白等电点，例如这个就可以http://ggene.cn/html/kuzhan/xinxixue/2016/0817/7314.html

你的Ni纯化不理想，可以试着做下0-100mM咪唑梯度洗脱，尽量把梯度拉长，试试看。

如果蛋白量本来就不低，可能表达就不太理想，试试换个结构，，我最近也在做类似工作，具体可以下来私聊相互讨论的
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8楼2017-10-11 09:32:02
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一颗行走的树

新虫 (初入文坛)
嗯嗯   谢谢   我的有一个融合蛋白又遇到问题了，纯化出来会沉淀

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9楼2017-10-11 09:44:07
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一颗行走的树

新虫 (初入文坛)
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10楼2017-10-11 09:45:31
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