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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于重叠pcr 有一些问题
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Leo郭浩

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于重叠pcr 有一些问题 已有2人参与

重叠pcr的引物方面，第一个基因的下游引物和第二个基因的上游引物，不都包含另一个片段的一小部分，那么如果我要融合的这两个基因片段是在同一个基因组上，那么如何保证，他们各自的特异结合呢，是靠长度吗。如果靠长度的话，那么同一个片段的上下游引物，退火温度差太多，该怎么选择呢？？

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1楼 2017-08-23 23:44:18
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by Leo郭浩 at 2017-08-24 13:50:37
不对，写错了。上面那个例子，您的退火温度是65？   
另外，在请问一下，这个体系的问题。我用这个PrimerStar的酶，50ul体系分别扩增出来两个目的片段，胶回收产物之后，先不加引物，把这两个片段混合扩增8-10个循 ...

8-10个循环的时候其他的组分按照正常操作标准添加，只是没有引物，后续拼接的时候可以选择直接加引物也可以选择取10ul的样子作为模板，再配一个体系，我都试过，两个的结果是一样的，有兴趣你也可以尝试一下。
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ControlMyself
6楼2017-08-25 10:07:13
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物的退火温度不要纠结，用好一点的酶，不要用taq酶，一般没问题，比平均TM值高2度，一般都很好的。你的目标是扩增，不是检测，所以只要扩出来就好了瓦。
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Leo郭浩
2楼2017-08-24 08:52:06
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
做融合蛋白，常规都是两段直接连接，记得起始密码子和终止密码子的位置即可，如果要WB，就在设计几个组，每个组分别在对应基因后面加his标签，应该是这样吧。
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3楼2017-08-24 08:53:52
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Leo郭浩

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-08-24 08:52:06
引物的退火温度不要纠结，用好一点的酶，不要用taq酶，一般没问题，比平均TM值高2度，一般都很好的。你的目标是扩增，不是检测，所以只要扩出来就好了瓦。

您好，您一般做，退火温度都是平均Tm值家2℃？   就比如一个是60，一个是66。您的退火温度是63？      另外，我用的是primerStar这种酶。

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Leo郭浩
4楼2017-08-24 13:05:07
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