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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增无条带，一片拖尾，求大神帮忙分析一下！
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如梦如幻

木虫 (小有名气)

[交流] PCR扩增无条带，一片拖尾，求大神帮忙分析一下！ 已有12人参与

各位大神帮我看看，我在做定点突变，用的Q5 高保真的聚合酶，结果扩增条带是一片弥散，我有调整过模板的添加量，引物添加量，提高退火温度，减少循环次数，增加延伸时间，结果还是这个样子，肿么办呢
第一张电泳图，由左到右，退火温度分别为57.3、63.4、67.3
第二张电泳图，由左到右，退火温度分别为69.3、68.0、66.1、63.8

PCR扩增无条带，一片拖尾，求大神帮忙分析一下！
N35Q.jpg


PCR扩增无条带，一片拖尾，求大神帮忙分析一下！-1
新N35Q.jpg
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1楼 2017-08-23 17:49:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 如梦如幻 at 2017-08-24 09:35:21
70ng
...

太多了。最多只能用1ng。太多模版会有这种情况
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
11楼2017-08-30 23:55:29
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PattyGao

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引物问题，你可以把你的引物分成两段，先扩出大片段，再连后续的引物
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8楼2017-08-24 17:06:00
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jerry110

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:31:37
定点突变扩环引物设计突变点两侧各15bp，GC含量高加1%DMSO，扩环循环18-20即可，个人建议仅供参考，祝好！
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9楼2017-08-28 10:51:41
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793534187

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有没考虑过引物有问题呢……你这完全没带形没产物呀……

发自小木虫IOS客户端
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2楼2017-08-23 19:02:15
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用了多少ng 质粒做模版？
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2017-08-23 23:22:38
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周大神

铜虫 (小有名气)
这个确实不好说，还是像楼上说的从引物出发

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面对阳光，努力生长
4楼2017-08-24 03:05:28
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zyfskj

新虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
什么都没p出来，，，，我建议你再设计一对引物出来，或者你做温度剃度，我也用Q5，可以多多交流

发自小木虫IOS客户端
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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
10楼2017-08-28 11:13:12
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Y野草Y

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有可能是高GC模板，可加5%DMSO，或10%甘油

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13楼2017-09-02 09:04:54
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普通回帖

如梦如幻

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 793534187 at 2017-08-23 19:02:15
有没考虑过引物有问题呢……你这完全没带形没产物呀……

我也觉得引物有问题，我序列本身GC含量特别高，定点突变引物设计确实不好弄

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5楼2017-08-24 09:34:55
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如梦如幻

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2017-08-23 23:22:38
用了多少ng 质粒做模版？

70ng

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6楼2017-08-24 09:35:21
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如梦如幻

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 周大神 at 2017-08-24 03:05:28
这个确实不好说，还是像楼上说的从引物出发

突变引物设计多长比较合适啊，我GC含量高，怎么调整也会有发卡结构

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7楼2017-08-24 09:36:25
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