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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCRp不出来？！！！
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ghst110 at 2017-08-22 13:13:15
你是用传统的酶切酶连来构建质粒，还是用Gibson Assembly/In Fusion?板上长出不是想要的菌落，不外两个原因：1.质粒残留：线性化载体不彻底；切胶回收残留。2污染，污染了外部细菌或者目的片段污染了小片段，这个小 ...

我是用传统的酶切酶连， 没有进行切胶，直接纯化后酶切
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11楼2017-08-22 16:02:28
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HAYDEN110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 临溪蜚蜚 at 2017-08-22 15:55:04
嗯嗯，程序是第一步95℃10min， 请问 “把菌收集后，用水洗一下”这个是怎么做？  我挑单克隆后是用20ul的LB+卡那摇的...

太少了，收集多一些菌液，比如，收集500ul，离心，去除培养液，再加个200ul去离子水适当浓缩一下，然后取1ul做菌液p，取多少p，就看你菌的浓度了

发自小木虫IOS客户端
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12楼2017-08-22 16:49:38
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chenllili

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 临溪蜚蜚 at 2017-08-22 15:55:04
嗯嗯，程序是第一步95℃10min， 请问 “把菌收集后，用水洗一下”这个是怎么做？  我挑单克隆后是用20ul的LB+卡那摇的...

20ul是不是有点少？

发自小木虫Android客户端
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13楼2017-08-22 21:11:48
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yufeiwaner

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:28:43
兄弟，用20微体系比较好，还有，你用的是你目的片段的引物，还是质粒上的通用引物？通用引物P不出来，说明长的都是杂菌，P出来条带小，则说明载体自连接严重。目的片段引物P不出来，则杂菌和空载都有可能。2微菌液相对于10微体系太多了。
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14楼2017-08-30 11:23:21
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:25
多半是目的片段没连接上，可能的错误有很多，我遇到过几次问题是连接酶体系的缓冲液有问题。其实PCR这些多半不太会错的。大部分原因总结下来都是缓冲液PH值有问题，不知道虫友有没有遇到同样的怪圈
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15楼2017-08-30 14:17:18
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能量车gogogo

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:42
阳性对照都没有条带：
1，可能是感受态有问题，根本就没有转进去，我前段时间也出现过这种跑步出条带的问题，最后发现是买的感受态有问题。
2，可能从一开始就没有连接上，自然也就转化不进去。
3，我一般用20ul 体系做菌液pcr,模板1ul,2Xpremix buffer（已经含有各种dNTP,以及taq酶） 10ul,引物各0.4ul,最后用水补充体系。
4，要是以上都没有问题，但还是跑步出条带，就是引物与模板的结合效率太低，试着重新设计引物把。
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人不会永远十七岁，但永远有人十七岁
16楼2017-09-02 21:36:53
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Isaac Li

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
17楼2017-09-05 11:48:47
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369443288

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

那就是可能假阳性咯，加点抗生素，蓝白斑筛选
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诞生之日
18楼2017-09-05 16:49:24
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wkj5257

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

做下菌落PCR试试，或者菌液进行梯度稀释，模板量过高也会抑制PCR反应
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分子生物学，未来科技的领导者
19楼2017-09-19 18:51:31
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