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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by ghst110 at 2017-08-22 13:13:15
你是用传统的酶切酶连来构建质粒,还是用Gibson Assembly/In Fusion?板上长出不是想要的菌落,不外两个原因:1.质粒残留:线性化载体不彻底;切胶回收残留。2污染,污染了外部细菌或者目的片段污染了小片段,这个小 ...

我是用传统的酶切酶连, 没有进行切胶,直接纯化后酶切
11楼2017-08-22 16:02:28
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HAYDEN110

银虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 临溪蜚蜚 at 2017-08-22 15:55:04
嗯嗯,程序是第一步95℃10min, 请问 “把菌收集后,用水洗一下”这个是怎么做?  我挑单克隆后是用20ul的LB+卡那摇的...

太少了,收集多一些菌液,比如,收集500ul,离心,去除培养液,再加个200ul去离子水适当浓缩一下,然后取1ul做菌液p,取多少p,就看你菌的浓度了

发自小木虫IOS客户端
12楼2017-08-22 16:49:38
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chenllili

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 临溪蜚蜚 at 2017-08-22 15:55:04
嗯嗯,程序是第一步95℃10min, 请问 “把菌收集后,用水洗一下”这个是怎么做?  我挑单克隆后是用20ul的LB+卡那摇的...

20ul是不是有点少?

发自小木虫Android客户端
13楼2017-08-22 21:11:48
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yufeiwaner

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:28:43
兄弟,用20微体系比较好,还有,你用的是你目的片段的引物,还是质粒上的通用引物?通用引物P不出来,说明长的都是杂菌,P出来条带小,则说明载体自连接严重。目的片段引物P不出来,则杂菌和空载都有可能。2微菌液相对于10微体系太多了。
14楼2017-08-30 11:23:21
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:25
多半是目的片段没连接上,可能的错误有很多,我遇到过几次问题是连接酶体系的缓冲液有问题。其实PCR这些多半不太会错的。大部分原因总结下来都是缓冲液PH值有问题,不知道虫友有没有遇到同样的怪圈
15楼2017-08-30 14:17:18
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能量车gogogo

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:42
阳性对照都没有条带:
1,可能是感受态有问题,根本就没有转进去,我前段时间也出现过这种跑步出条带的问题,最后发现是买的感受态有问题。
2,可能从一开始就没有连接上,自然也就转化不进去。
3,我一般用20ul 体系做菌液pcr,模板1ul,2Xpremix buffer(已经含有各种dNTP,以及taq酶) 10ul,引物各0.4ul,最后用水补充体系。
4,要是以上都没有问题,但还是跑步出条带,就是引物与模板的结合效率太低,试着重新设计引物把。
人不会永远十七岁,但永远有人十七岁
16楼2017-09-02 21:36:53
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Isaac Li

禁虫 (著名写手)

本帖内容被屏蔽

17楼2017-09-05 11:48:47
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369443288

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

那就是可能假阳性咯,加点抗生素,蓝白斑筛选
诞生之日
18楼2017-09-05 16:49:24
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wkj5257

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

做下菌落PCR试试,或者菌液进行梯度稀释,模板量过高也会抑制PCR反应
分子生物学,未来科技的领导者
19楼2017-09-19 18:51:31
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