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全质粒PCR如何操作 已有2人参与
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目的：通过PCR环拉将点突变引入质粒中，也就是全质粒PCR， 提问：请问如何实现呢，质粒大约是4400bp，好操作吗？具体的操作步骤是什么，需要用到特殊的聚合酶吗 |
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hua_geduo
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2楼2017-08-17 11:42:41
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drwhoknowss: 金币+3, 可行 2018-02-05 11:55:13
drwhoknowss: 金币+3, 可行 2018-02-05 11:55:13
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载体4400算好做的，我们lab的载体加插入片段基本在8000左右，基本没什么问题。不想麻烦就买kit，很多种。自己做的话，关键是设计引物和高保真酶，经常做建议买NEB的phusion， invitrogen的pfx比较好用，国内诺唯赞的Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase也还行。之前给师妹写过sop，有啥问题欢迎随时讨论。 1. 梯度PCR 引物序列送生工合成，到了后离心加PCR级水至100uM（保存），取5ul再加45ul水稀释至10uM用。模板稀释到5ng/ul。 20ul pcr体系，1ul稀释后的模板，稀释后的正反引物各加1ul，按你用的酶的体系加酶、buff、dNTP mix，用水补到20ul。最好做4.5X mix，分成4管。 PCR cycle设置按酶说明说来，退火温度设梯度，60\62\64\66度。 PCR结束后取8ul跑1%琼脂糖胶，根据marker判断8kb左右是否有条带，如果有突变成功。 2. 酶切、转化 取突变成功的退火温度，加0.5-1ul Dpn1酶切6h，或过夜。（可以加2ul Dpn1，酶切2h） 酶切后的产物转化大肠杆菌，5-10ul产物加到30-60ul DH5a，手轻弹，冰上放置30min， 42度热激30s，放回冰上2min。加入600ul 液体LB培养液，37度摇床1-2h，结束后3000rpm离心3min，弃550ul上清，用剩余溶液混匀菌体沉淀（枪吹打，缓），混匀后加到固体LB培养基上，涂布均匀后放置到37度烘箱，10min后颠倒放置，过夜。 隔夜，挑单克隆摇菌。挑3-5个单克隆，每个摇菌管中加入4ml LB培养液+4ul 氨苄抗生素（确认下你的质粒的抗性，氨苄、卡那比较多），摇床37度、220转摇15h。 3. 抽质粒，送测序 用小抽试剂盒抽质粒，步骤找说明书。定量后，按生工送测序要求稀释质粒。 4. 序列比对 Blast https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/B ... ;LINK_LOC=blasthome 或Clustal Omega https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ |
4楼2018-02-05 11:06:16
lyn3400189
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