应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全质粒PCR如何操作
61/1返回列表
查看: 9237  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zdty

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 全质粒PCR如何操作 已有2人参与

目的：通过PCR环拉将点突变引入质粒中，也就是全质粒PCR，
提问：请问如何实现呢，质粒大约是4400bp，好操作吗？具体的操作步骤是什么，需要用到特殊的聚合酶吗
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-08-16 15:00:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般不这么做吧，如果你实在要这么做4400的片段要用长片段扩增的酶了，祝好运
赞一下 回复此楼
2楼2017-08-17 11:42:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l斜月三星

新虫 (初入文坛)
同问

发自小木虫Android客户端
回复此楼
3楼2018-02-04 09:40:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
drwhoknowss: 金币+3, 可行 2018-02-05 11:55:13
载体4400算好做的，我们lab的载体加插入片段基本在8000左右，基本没什么问题。不想麻烦就买kit，很多种。自己做的话，关键是设计引物和高保真酶，经常做建议买NEB的phusion， invitrogen的pfx比较好用，国内诺唯赞的Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase也还行。之前给师妹写过sop，有啥问题欢迎随时讨论。

1. 梯度PCR

引物序列送生工合成，到了后离心加PCR级水至100uM（保存），取5ul再加45ul水稀释至10uM用。模板稀释到5ng/ul。

20ul pcr体系，1ul稀释后的模板，稀释后的正反引物各加1ul，按你用的酶的体系加酶、buff、dNTP mix，用水补到20ul。最好做4.5X mix，分成4管。

PCR cycle设置按酶说明说来，退火温度设梯度，60\62\64\66度。

PCR结束后取8ul跑1%琼脂糖胶，根据marker判断8kb左右是否有条带，如果有突变成功。

2. 酶切、转化

取突变成功的退火温度，加0.5-1ul Dpn1酶切6h，或过夜。（可以加2ul Dpn1，酶切2h）

酶切后的产物转化大肠杆菌，5-10ul产物加到30-60ul DH5a，手轻弹，冰上放置30min，

42度热激30s，放回冰上2min。加入600ul 液体LB培养液，37度摇床1-2h，结束后3000rpm离心3min，弃550ul上清，用剩余溶液混匀菌体沉淀（枪吹打，缓），混匀后加到固体LB培养基上，涂布均匀后放置到37度烘箱，10min后颠倒放置，过夜。

隔夜，挑单克隆摇菌。挑3-5个单克隆，每个摇菌管中加入4ml LB培养液+4ul 氨苄抗生素（确认下你的质粒的抗性，氨苄、卡那比较多），摇床37度、220转摇15h。

3. 抽质粒，送测序

用小抽试剂盒抽质粒，步骤找说明书。定量后，按生工送测序要求稀释质粒。

4. 序列比对

Blast

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/B ... ;LINK_LOC=blasthome

或Clustal Omega

https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
赞一下 回复此楼
2019更好更棒!
4楼2018-02-05 11:06:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyn3400189

银虫 (正式写手)
野生型为模板，突变点设计到引物中，一步到位

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2018-04-24 01:25:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超人爱吃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-02-05 11:06:16
载体4400算好做的，我们lab的载体加插入片段基本在8000左右，基本没什么问题。不想麻烦就买kit，很多种。自己做的话，关键是设计引物和高保真酶，经常做建议买NEB的phusion， invitrogen的pfx比较好用，国内诺唯赞的 ...

能麻烦楼主说一下如何设计引物吗？两个引物需要有重叠吗

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2023-04-10 16:31:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zdty 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 318求调剂 +4 plum李子 2026-03-21 7/350 2026-03-22 14:17 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +7 Auroracx 2026-03-22 7/350 2026-03-22 12:38 by 素颜倾城1988
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 4/200 2026-03-22 11:04 by 搏击518
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +11 吃吃吃才有意义 2026-03-19 11/550 2026-03-21 18:23 by 学员8dgXkO
[考研] 材料学硕333求调剂 +3 北道巷 2026-03-18 3/150 2026-03-21 18:17 by 学员8dgXkO
[考研] 0703化学297求调剂 +3 Daisy☆ 2026-03-20 3/150 2026-03-21 17:45 by ColorlessPI
[考研] 306求0703调剂一志愿华中师范 +5 纸鱼ly 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:11 by 学员8dgXkO
[考研] 299求调剂 +4 某某某某位 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:30 by barlinike
[考研] 22 350 本科985求调剂，求老登收留 +3 李轶男003 2026-03-20 3/150 2026-03-21 13:28 by 搏击518
[考研] 南昌大学材料专硕311分求调剂 +6 77chaselx 2026-03-20 6/300 2026-03-21 07:24 by JourneyLucky
[考研] 二本跨考郑大材料306英一数二 +3 z1z2z3879 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:29 by JourneyLucky
[考研] 一志愿武理材料305分求调剂 +6 想上岸的鲤鱼 2026-03-18 7/350 2026-03-21 01:03 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:46 by JourneyLucky
[考研] 317求调剂 +5 申子申申 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:26 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +4 晨昏线与星海 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:15 by JourneyLucky
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +4 @taotao 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:14 by JourneyLucky
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +7 困于星晨 2026-03-17 9/450 2026-03-20 17:38 by 无懈可击111
[考研] 081700化工学硕调剂 +3 【1】 2026-03-16 3/150 2026-03-19 23:40 by edmund7
[考研] 生物学调剂招人！！！ +3 山海天岚 2026-03-17 4/200 2026-03-19 21:34 by 怎么释怀
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭