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王木木2016

新虫 (小有名气)

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[求助] 纯化后的蛋白电泳不出目的条带已有1人参与

我的蛋白是可溶性蛋白，纯化后洗脱液能看到白色沉淀，之前电泳出目的条带了，但最近电泳不出来目的条带了，请问是什么原因啊？

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1楼 2017-08-13 09:45:16

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

晋鹏

版主 (知名作家)

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管辖: 农林

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1: 参考抗体说明书，准备阳性对照，刚买的抗体一定要做这一步，排除抗体质量的问题。
2:在抗体没有失效的情况下，检测下面几个问题
a：细胞一般是不会出神马问题的，但是裂解液这个东西还是需要考虑的。遇到一个很经典的事情，用得公司买的RIPA裂解细胞，beta-actin的条带好看的不得了，目的条带就是木有，后来发现就是裂解液出问题的，换了裂解液立马正常了。
b：样品木有问题了，遇到不好用得抗体，加大上样量，有助于条带的出现。
根据目的蛋白选择合适的胶的浓度，以及转膜的时间（这个还是很重要，转膜不充分，转膜过了都会导致目的条带出不来）。
一抗最好4°过夜。
洗膜的缓冲液的PH还是很重要，要调准。
后面二抗应该不会出神马问题的，但是还是需要考虑的。
曝光延长时间。

每一步出错都有可能导致条带出不来的。你没有写具体的步骤，上面只是讲了下我想到的要注意的几方面的问题，希望对你有帮助。

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及时行乐，人生不留遗憾！

2楼2017-08-13 15:00:12