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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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hy_123

新虫 (初入文坛)

[求助] 总是p不出来目标带 已有2人参与

新手求助:我要扩增全长1902bp的CDS片段,上游引物是CATGGCGGCCGCCGTGCAGC 下游引物:GAGCTCATGGCGCCGGCGCC
体系:ddH2O:2ul cDNA:2ul buffer:5ul dNTPs:5ul Mg2+:3ul 引物各1ul KOD PLUS NEO:1ul
两步法:预变性:94℃2min 变性:98℃10s 延伸:68℃1min 再延伸72℃5min   用的是2000的maker
之前跑三步法没跑出啦,两步法也不行,我的退火温度算出来72℃。新手被折磨死了!

总是p不出来目标带


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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-08-15 07:04:04
要看你的反应体系是不是有问题,是不是药品换了或者是污染了,

把反应体系中的每一种药品都要进行验证,看是否有问题,

也有可能是引物用的时间长了,还有PCR程序有没有问题,PCR仪的问题等。
及时行乐,人生不留遗憾!
2楼2017-08-11 15:40:31
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从此以后fei

新虫 (初入文坛)

有可能是延伸温度的问题,可以做一个梯度PCR探索一下

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4楼2017-08-11 16:58:18
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ladejueshi

金虫 (正式写手)

退火温度太高了,降到50度先试试能出吧,如果有杂带在提高点

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10楼2017-08-12 10:19:10
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enjoy大志

铜虫 (小有名气)

G+C含量太高,建议重新设计引物,你也可以尝试换一种buffer,专门针对高gc含量的,takala有;或者做TD-pcr

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付出定有回报
11楼2017-08-14 21:56:39
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hzau103

新虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by hy_123 at 2017-08-11 17:08:57
我是打算拿到引物后设置一下温度梯度,换个酶试试的,不知道有没有推荐,我的目的片段设计引物的GC含量80%,扩增的是CDS片段,所以我的引物怎么改,gc含量都很高。
...

那就要用PCR增强剂,或者专门针对高GC的mix。

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12楼2017-08-14 22:21:16
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漫漫123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换一种高扩增效率的Taq酶,再不行就全基因合成,也有可能你的CDS序列并不存在。换个同家族的其他基因扩一下试试。
13楼2017-08-15 14:07:42
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ufo007ahh

铜虫 (初入文坛)

多定几对引物试一试。我觉得不出带和梯度没什么太大关系,温度影响特异性多一些,不合适可能有杂带。一般来说55度能出带60度也没问题。

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16楼2017-08-15 21:35:05
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普通回帖

hy_123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 15:40:31
要看你的反应体系是不是有问题,是不是药品换了或者是污染了,

把反应体系中的每一种药品都要进行验证,看是否有问题,

也有可能是引物用的时间长了,还有PCR程序有没有问题,PCR仪的问题等。

体系中药品和仪器应该没问题,同学也在用,也能p出来带。

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3楼2017-08-11 16:55:31
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晋鹏

版主 (知名作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hy_123 at 2017-08-11 16:55:31
体系中药品和仪器应该没问题,同学也在用,也能p出来带。
...

PCR程序 是否需要优化呢?如果都没有问题,那为什么不请教同学给你P一下呢?
及时行乐,人生不留遗憾!
5楼2017-08-11 16:59:31
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hy_123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 从此以后fei at 2017-08-11 16:58:18
有可能是延伸温度的问题,可以做一个梯度PCR探索一下

我打算试试的,因为我这个退火温度太高,一开始用三步法没p出来,然后用的是两步法,但是还是一直p不出来,换了模板后两步法也p不出来,然后打算换三步法再试试。

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6楼2017-08-11 17:04:31
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hy_123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 16:59:31
PCR程序 是否需要优化呢?如果都没有问题,那为什么不请教同学给你P一下呢?...

我们p的基因都不同,每个人做的是自己的。

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7楼2017-08-11 17:06:35
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hy_123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 16:59:31
PCR程序 是否需要优化呢?如果都没有问题,那为什么不请教同学给你P一下呢?...

我是打算拿到引物后设置一下温度梯度,换个酶试试的,不知道有没有推荐,我的目的片段设计引物的GC含量80%,扩增的是CDS片段,所以我的引物怎么改,gc含量都很高。

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8楼2017-08-11 17:08:57
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吴秋兰

新虫 (小有名气)

我也是有一段gc含量比较高的基因,一直弄不出来

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9楼2017-08-12 10:05:41
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