应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 总是p不出来目标带
181/2返回列表12下一页
查看: 2355  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hy_123

新虫 (初入文坛)

[求助] 总是p不出来目标带 已有2人参与

新手求助：我要扩增全长1902bp的CDS片段，上游引物是CATGGCGGCCGCCGTGCAGC 下游引物：GAGCTCATGGCGCCGGCGCC
体系：ddH2O:2ul cDNA：2ul buffer:5ul dNTPs:5ul Mg2+:3ul 引物各1ul KOD PLUS NEO:1ul
两步法：预变性：94℃2min 变性：98℃10s 延伸：68℃1min 再延伸72℃5min   用的是2000的maker
之前跑三步法没跑出啦，两步法也不行，我的退火温度算出来72℃。新手被折磨死了！

总是p不出来目标带


发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2017-08-11 14:31:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-08-15 07:04:04
要看你的反应体系是不是有问题，是不是药品换了或者是污染了，

把反应体系中的每一种药品都要进行验证，看是否有问题，

也有可能是引物用的时间长了，还有PCR程序有没有问题，PCR仪的问题等。
赞一下(1人) 回复此楼
及时行乐，人生不留遗憾！
2楼2017-08-11 15:40:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

从此以后fei

新虫 (初入文坛)
有可能是延伸温度的问题，可以做一个梯度PCR探索一下

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2017-08-11 16:58:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ladejueshi

金虫 (正式写手)
退火温度太高了，降到50度先试试能出吧，如果有杂带在提高点

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2017-08-12 10:19:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

enjoy大志

铜虫 (小有名气)
G+C含量太高，建议重新设计引物，你也可以尝试换一种buffer，专门针对高gc含量的，takala有；或者做TD-pcr

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
付出定有回报
11楼2017-08-14 21:56:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hzau103

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hy_123 at 2017-08-11 17:08:57
我是打算拿到引物后设置一下温度梯度，换个酶试试的，不知道有没有推荐，我的目的片段设计引物的GC含量80%，扩增的是CDS片段，所以我的引物怎么改，gc含量都很高。
...

那就要用PCR增强剂，或者专门针对高GC的mix。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2017-08-14 22:21:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

漫漫123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换一种高扩增效率的Taq酶，再不行就全基因合成，也有可能你的CDS序列并不存在。换个同家族的其他基因扩一下试试。
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2017-08-15 14:07:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ufo007ahh

铜虫 (初入文坛)
多定几对引物试一试。我觉得不出带和梯度没什么太大关系，温度影响特异性多一些，不合适可能有杂带。一般来说55度能出带60度也没问题。

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
16楼2017-08-15 21:35:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

hy_123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 15:40:31
要看你的反应体系是不是有问题，是不是药品换了或者是污染了，

把反应体系中的每一种药品都要进行验证，看是否有问题，

也有可能是引物用的时间长了，还有PCR程序有没有问题，PCR仪的问题等。

体系中药品和仪器应该没问题，同学也在用，也能p出来带。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-08-11 16:55:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

晋鹏

版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hy_123 at 2017-08-11 16:55:31
体系中药品和仪器应该没问题，同学也在用，也能p出来带。
...

PCR程序 是否需要优化呢？如果都没有问题，那为什么不请教同学给你P一下呢？
赞一下 回复此楼
及时行乐，人生不留遗憾！
5楼2017-08-11 16:59:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hy_123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 从此以后fei at 2017-08-11 16:58:18
有可能是延伸温度的问题，可以做一个梯度PCR探索一下

我打算试试的，因为我这个退火温度太高，一开始用三步法没p出来，然后用的是两步法，但是还是一直p不出来，换了模板后两步法也p不出来，然后打算换三步法再试试。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2017-08-11 17:04:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hy_123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 16:59:31
PCR程序 是否需要优化呢？如果都没有问题，那为什么不请教同学给你P一下呢？...

我们p的基因都不同，每个人做的是自己的。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
7楼2017-08-11 17:06:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hy_123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 16:59:31
PCR程序 是否需要优化呢？如果都没有问题，那为什么不请教同学给你P一下呢？...

我是打算拿到引物后设置一下温度梯度，换个酶试试的，不知道有没有推荐，我的目的片段设计引物的GC含量80%，扩增的是CDS片段，所以我的引物怎么改，gc含量都很高。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
8楼2017-08-11 17:08:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吴秋兰

新虫 (小有名气)
我也是有一段gc含量比较高的基因，一直弄不出来

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2017-08-12 10:05:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hy_123 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭