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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 总是p不出来目标带
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enjoy大志

铜虫 (小有名气)
G+C含量太高，建议重新设计引物，你也可以尝试换一种buffer，专门针对高gc含量的，takala有；或者做TD-pcr

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付出定有回报
11楼2017-08-14 21:56:39
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hzau103

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hy_123 at 2017-08-11 17:08:57
我是打算拿到引物后设置一下温度梯度，换个酶试试的，不知道有没有推荐，我的目的片段设计引物的GC含量80%，扩增的是CDS片段，所以我的引物怎么改，gc含量都很高。
...

那就要用PCR增强剂，或者专门针对高GC的mix。

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12楼2017-08-14 22:21:16
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漫漫123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换一种高扩增效率的Taq酶，再不行就全基因合成，也有可能你的CDS序列并不存在。换个同家族的其他基因扩一下试试。
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13楼2017-08-15 14:07:42
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hy_123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by enjoy大志 at 2017-08-14 21:56:39
G+C含量太高，建议重新设计引物，你也可以尝试换一种buffer，专门针对高gc含量的，takala有；或者做TD-pcr

引物已经重新设计过了，特异性很好，gc含量高实在没办法，扩增的是cds，然后已经还往utr端延伸几个碱基，但是gc含量还是高。然后现在换了一个酶跑梯度，跑出来了，但是再次用同样的条件就再也重复不了了。跑的都是梯度第一张最高是67℃，然后酶用的是kod fx。
总是p不出来目标带



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14楼2017-08-15 16:05:09
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hy_123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by hy_123 at 2017-08-15 16:05:09
引物已经重新设计过了，特异性很好，gc含量高实在没办法，扩增的是cds，然后已经还往utr端延伸几个碱基，但是gc含量还是高。然后现在换了一个酶跑梯度，跑出来了，但是再次用同样的条件就再也重复不了了。跑的都是 ...

这是跑出来的。片段带是1902bp，不同温度，第二条是最高是67℃，最后一条是61℃。
总是p不出来目标带-1



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15楼2017-08-15 16:07:56
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ufo007ahh

铜虫 (初入文坛)
多定几对引物试一试。我觉得不出带和梯度没什么太大关系，温度影响特异性多一些，不合适可能有杂带。一般来说55度能出带60度也没问题。

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16楼2017-08-15 21:35:05
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
换GC buffer 宝生物有款酶 LAtqa？
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麻辣王子不爱做实验
17楼2017-08-16 11:05:05
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luoyl210

新虫 (著名写手)
多么巧合，我之前做了三个月都没做出来的克隆就是1902bp。但是我可以跑出来PCR，第一你再检测一下引物有没有问题，第二，看试剂是否过期，污染。第三，可以尝试换一种酶。第四，跑梯度PCR摸索退火温度，算得不一定准的。如果还不行，参考序列没问题的话，可以设计两条引物，拼接起来。

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18楼2017-08-16 12:55:09
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