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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 科学小白，刚入师门，最近在质粒抽提方面遇到了极大的困扰，请大家排忧解难。
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更强

新虫 (著名写手)

[求助] 科学小白，刚入师门，最近在质粒抽提方面遇到了极大的困扰，请大家排忧解难。 已有2人参与

我最近在做大肠杆菌的转化涂板，可是成效不佳。涂板实验已经做了三次了，第一次长菌了，但是菌落pcr没结果，失败了重来。第二次涂板没有长菌，三种基因四个板子均没有长菌迹象，开始分析认为是没有连接上，后来电泳检测载体，发现载体浓度很低，这可能会成为影响实验的一部分。另外，考虑到是不是引物设计错了，师兄又帮我检测了一下，引物设计是对的。但是没有找到失败的原因。第三次，将初始pcr基因再pcr，获得浓度更高的回收产物，载体用的是二师兄给的酶切成功的载体，进行链接转化后，摇菌离心后发现菌体颜色非黄白色，而是浅黑色，当时怀疑菌落里面是否污染了杂菌（五个管子同时都是这样），我追问师兄，他也未能给出确切答复，只是让我继续涂板看结果再判断。今早来的时候发现还是没有长菌。我用的两种载体，认真选择了氨苄和卡娜的培养基，并且涂板的时候也高度认真，但是仍然不知道错在了哪里。所以希望大家可以伸出援手，授人以渔。谢谢！

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1楼 2017-08-11 09:07:49
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YellowDoggy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一次长菌了，但是菌落pcr没结果，一种可能是没有连接上，也有可能是根本就没有转进去。结合后面两次失败的情况，可能是感受态的效果不好或已经污染，可以使用商用感受态做阳性对照
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2楼2017-08-11 11:26:33
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大别克

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.确定载体和产物没问题后，将感受态细胞用标准质粒转化测试一下效价，可以用已知浓度的质粒稀释到1ng转化试试看长斑量，或者转化时顺便转个空载看看
2关于说离心后菌体呈浅黑色，而且五管都一样，在排除效价没问题的前下，可能是制备感受态所用的培养基不是很干净.
3.载体再点一下，浓度低就不要用的
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3楼2017-08-11 13:26:45
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1205vivia

银虫 (小有名气)
从结果上看，最后一次可能长的是杂菌，所以涂板才不长，

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4楼2017-08-11 14:19:32
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更强

新虫 (著名写手)
谢谢

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5楼2017-08-11 16:40:02
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