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瓜皮没沃皮

新虫 (初入文坛)
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qPCR污染分析及解决方案
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小弟现在qPCR遇污染问题，一直解决不了，不好意思再去找老板，求实验大神帮我看看。近期的qPCR阴性（水）对照总是污染，CT值不稳定，在30——35徘徊，呈假阳性。（ct36以上才算阴性）
         实验环境：两月之前提过阳性样品的EP枪，上星期找公司的人来洗了一遍。一对引物，TaqMan探针都是新拿出来的，在提过样品的实验室里的超净台加水溶解的。加样在办公室的超净台进行的，配药的总管用之前在100℃干燥烘箱里吹了3小时直到使用。阳性样品扩增片段380bp，超净台提前开紫外。开风机操作，20微反应体系，ep枪19微分装排管。用ep的枪，3、4号位点公司的dd水，5、6号位点自己灭菌的up水，7、8号位不点，关风机。最后1、2号位用大龙的枪，滤嘴枪头点阳性对照，点完换手套盖排管盖。
结果：
             1、2号ct 20.3、21.2。
             3、4号ct 34.6、35.1。
             5、6号ct 35.2、31.4。
             7、8号ct 29.6、30.5。
药品换了几批，枪也换了多套，也洗过，加样去的办公室。污染偶尔控制在35，一大批量做荧光定量，阴性污染又飙升起来。
         EP的机子别人做qPCR就没问题。只能怀疑实验室气溶胶污染，溶解引物和探针时实验室气溶胶会污染药品嘛，连锁反应造成阴性对照污染？还是探针有问题，反应后期5'端FAM基团会自己放出信号嘛？引物与探针序列我都没有。纯实验小白实验很多地方不懂，也看不懂测试实验结果。
         问题表述的也不清楚，不过还是希望实验大佛帮我瞧瞧怎么回事，怎么拿出解决方案，要怎么去跟老板交代。兜里只有这么点金币都掏出来了，orz。。。

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1楼 2017-08-08 22:47:47
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伤何处

木虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-08-09 07:47:45
拿水做阴性对照的时候，不能单看CT值吧，还需要看下扩增曲线，看看是否确实扩增了。还有就是溶解曲线，是否有正常的峰  如果没有的话 这样的是不是可以忽略掉？  因为我看有时候溶解曲线在引物二聚体那个峰的时候，它也会有CT值
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11楼2017-08-08 23:51:31
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瓜皮没沃皮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-08-08 23:51:31
拿水做阴性对照的时候，不能单看CT值吧，还需要看下扩增曲线，看看是否确实扩增了。还有就是溶解曲线，是否有正常的峰  如果没有的话 这样的是不是可以忽略掉？  因为我看有时候溶解曲线在引物二聚体那个峰的时候， ...

谢谢，探针法没有做溶解曲线。阴性模板在30个循环后出现上抛物线，扩增，拐点明显。

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12楼2017-08-09 09:04:11
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polo_lai

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
因你的阴性（DEPC H2O）均有扩增曲线，建议为了进一步确认是不是实验室气溶胶污染，重新设计一套引物探针再试试？！若没问题则表明实验室污染~！
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13楼2017-11-20 11:51:33
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hx19940519

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的也出现这种问题 请问解决了吗？
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14楼2018-09-05 16:25:54
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KGWD2楼
2017-08-08 22:48   回复  
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youku_zhc13楼
2017-08-08 22:48   回复  
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zizhuydd4楼
2017-08-08 22:49   回复  
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cwdljmcx5楼
2017-08-08 22:49   回复  
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右手6楼
2017-08-08 22:50   回复  
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likun_20087楼
2017-08-08 22:50   回复  
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地下党298楼
2017-08-08 22:50   回复  
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太阳当空照89楼
2017-08-08 22:50   回复  
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懒懒行空10楼
2017-08-08 22:50   回复  
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