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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 摇菌6小时左右就目测浑浊了，是怎么回事？
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)

[求助] 摇菌6小时左右就目测浑浊了，是怎么回事？

构建质粒，经过酶切连接，再转化到大肠杆菌E.Coli。在有抗性的平板上挑取生长出来的单菌落，放到带有同样抗性的液体LB摇菌。37度，220转每分钟，大约6小时，就目测液体比较浑浊了。这是怎么了？（后来，我把未接种任何细菌的LB液体培养基置于同样的条件摇了约18小时，未见浑浊。）

用试剂盒提取质粒送去测序，得到的峰很杂乱，不能读出信息。在测序前，先用PCR根据构建了的质粒进行粗筛，得到了目的条带，但是部分质粒样品出现了非特异条带（目的条带约600bp，非特异条带约4000bp）。


估计质粒样品很不纯。请问我该怎样补救（得到一个意见：把提取的质粒样品再转化一次到大肠杆菌，同时提高筛选平板的抗生素浓度）？还是希望不再做一回酶切连接了。请各位大侠不吝赐教！
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1楼 2017-08-04 16:27:42
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最爱琪琪

新虫 (小有名气)
之前听测序公司的人说可以重新图板，他们意思是挑的不是单菌落

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2楼2017-08-04 21:14:22
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极北小白熊

铁虫 (正式写手)
有杂带表明连接可能出问题，目的片段不纯，测序杂峰表明菌有问题，，如果连接产物没问题，可以划线，如果不能确定连接产物，最好重做，免得日后麻烦。。。

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3楼2017-08-05 09:37:25
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 极北小白熊 at 2017-08-05 09:37:25
有杂带表明连接可能出问题，目的片段不纯，测序杂峰表明菌有问题，，如果连接产物没问题，可以划线，如果不能确定连接产物，最好重做，免得日后麻烦。。。

PCR的时候退火温度比较低，53度。

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4楼2017-08-05 15:58:16
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极北小白熊

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 钱塘幼麟 at 2017-08-05 15:58:16
PCR的时候退火温度比较低，53度。
...

切胶测序，做一下就知道了。

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

钱塘幼麟
5楼2017-08-05 16:00:16
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 极北小白熊 at 2017-08-05 16:00:16
切胶测序，做一下就知道了。
...

我把前面的质粒样品重新转化到E.coli，在固体选择培养基里增加了抗生素的浓度。转化得到的菌种再提取质粒。而后，用PCR根据目的插入序列，进行扩增，这次目的条带都没有。要不是非特异条带，要不就是空白。

怎么办？绝望！
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6楼2017-08-07 00:11:30
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 极北小白熊 at 2017-08-05 16:00:16
切胶测序，做一下就知道了。
...

刚才仔细看了一下，“空白”的泳道，发现模糊出现了一个条带，这个条带指向没有插入。
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7楼2017-08-07 00:16:32
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nfprjx162
8楼2017-08-19 11:57:39
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