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用普通的酶扩增出目的条带后，怎么做 TA克隆呢？ 发自小木虫Android客户端 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2017-08-04 07:43:16
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TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法.因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性,通常在3加上A.例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,PCR反应时在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端.只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接. 通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中,由于往往不清楚目的基因的DNA序列,获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法,重组到T-载体中,通过序列测定清楚DNA序列. 一、PCR产物的TA克隆 1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。 2.操作步骤 ⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 ⑵ 10μl体积反应体系如下： ①取T载体1μl (50ng)，加入等摩尔数PCR产物 。 ②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补足至10μl 。 ⑶ 稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。 ⑷ 转染，蓝白斑筛选同前。 二、注意事项 1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。 2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。 3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。 三、经验分享。 1，要获得高效的连接，连接酶的选择很关键，如果选择T4DNA连接酶，连接时间需要过夜，而且还需要对连接产物进行纯化后方可转化。费时费力。我个人选择的TAKARA的连接KIT，进行TA克隆只要两个小时就可以保证高效的连接，而且连接后不需要纯化。节省了很多宝贵的时间。 2。对于PCR产物放置很久而要进行的TA克隆的问题，有些人担心3’端的A都掉了，会影响克隆效率。我在做的时候也是这样考虑，于是做了加A处理，然后进行连接，可是这样做连接效率真的很低，我检了16个克隆才出现一个阳性的转化子。于是我加A后做了纯化，连接效率得到了提高。所以做实验的时候千万不要省略任何一个步骤，不然会影响实验结果的。 |
2楼2017-08-03 17:50:39
zhouxfd
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3楼2017-08-04 00:00:52
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