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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 胶回收后的DNA片段每次做克隆都失败，是什么原因？
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肥猫p

木虫 (正式写手)

[求助] 胶回收后的DNA片段每次做克隆都失败，是什么原因？ 已有1人参与

我硕博期间一直在做分子生物学方面实验，那时候实验室对DNA胶回收，然后进行T4连接、Infusion连接等克隆都没什么问题。
毕业后来到一个新实验室，这个实验室有个魔咒，那就是胶回收后的DNA片段做Gibson，怎么都做不成功。我刚来不信邪，构建2个新质粒，一开始用胶回收纯化片段，回收后浓度正常，但是真的不长转化子or很少很小的几个假阳性。同样的实验设计，当我改为不胶回收，而直接用DpnI消化+柱纯化的方式，就能做出来。我思考了各种原因，实在不明白为什么，不知道小木虫上能否有大神可以解答，谢谢！

我列出2个实验室可能的不同点：
1）原实验室用的EB，新实验室用的生工的4S Red染料。
2）原实验室胶回收kit为Axygen的，新实验室为生工kit。
3）原实验室为商用DH5a感受态，新实验室为自己制备DH5a感受态，但感受态转化效率也是够的。
4）原实验室T4或Infusion连接，对于Infusion我四片段连接也几乎不失手；新实验室使用NEB的Gibson，而我做的是3片段连接，载克隆体系中DNA浓度均相同的情况下，胶回收来源的DNA片段就是无法成功Gibson连接。
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1楼 2017-07-31 10:07:25
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-08-01 07:45:07
总体来说肯定是其中出了什么问题，我估计是不是因为胶的问题，是不是琼脂糖不纯，有核酸酶污染，根据你的推测：
1. 我觉得很可能是原因之一，用EB染试试
2.这个应该没有什么区别把
3. 感受态应该也没有问题，如果激质粒能出很多的话
4. 一般Gibson是3：1比例，但是一个不出也很奇怪

总之，用以前实验室用的体系原封不动的在新实验室试试
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2楼2017-08-01 04:24:45
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llnyc

新虫 (初入文坛)
三个片段很好连的，如果胶回收连不上，很大的原因是你胶回收洗脱时用的试剂盒里面的elution buffer，这是碱性的，对你后面的连接体系影响很大，你可以试试用ddH2O洗脱试试，我做过对比，差别很大很大！
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3楼2017-09-22 16:05:17
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猪妹妹May

铁虫 (初入文坛)
最近在做gibson也遇到这样的问题，就是涂的平板都长不出来。6500的载体，连100bp的片段。酶切的电泳结果、insert的PCR结果都正确，连接是50℃，1h；然后热激涂板。
T4做的出来，但gibson不行，很疑惑。不知是否能给点建议？
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4楼2018-11-30 19:21:42
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Mary Jane

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 肥猫p at 2017-07-31 03:07:25
我硕博期间一直在做分子生物学方面实验，那时候实验室对DNA胶回收，然后进行T4连接、Infusion连接等克隆都没什么问题。
毕业后来到一个新实验室，这个实验室有个魔咒，那就是胶回收后的DNA片段做Gibson，怎么都做不 ...

想请问一下，您成功了吗，我也遇到了这样的问题，都构建快四个月了。。。
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5楼2022-02-10 16:03:34
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