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肥猫p木虫 (正式写手)
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胶回收后的DNA片段每次做克隆都失败，是什么原因？ 已有1人参与
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我硕博期间一直在做分子生物学方面实验，那时候实验室对DNA胶回收，然后进行T4连接、Infusion连接等克隆都没什么问题。 毕业后来到一个新实验室，这个实验室有个魔咒，那就是胶回收后的DNA片段做Gibson，怎么都做不成功。我刚来不信邪，构建2个新质粒，一开始用胶回收纯化片段，回收后浓度正常，但是真的不长转化子or很少很小的几个假阳性。同样的实验设计，当我改为不胶回收，而直接用DpnI消化+柱纯化的方式，就能做出来。我思考了各种原因，实在不明白为什么，不知道小木虫上能否有大神可以解答，谢谢！ 我列出2个实验室可能的不同点： 1）原实验室用的EB，新实验室用的生工的4S Red染料。 2）原实验室胶回收kit为Axygen的，新实验室为生工kit。 3）原实验室为商用DH5a感受态，新实验室为自己制备DH5a感受态，但感受态转化效率也是够的。 4）原实验室T4或Infusion连接，对于Infusion我四片段连接也几乎不失手；新实验室使用NEB的Gibson，而我做的是3片段连接，载克隆体系中DNA浓度均相同的情况下，胶回收来源的DNA片段就是无法成功Gibson连接。 |
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