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晋鹏
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+6, 鼓励热心回帖交流 2017-07-19 07:46:43
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1、端粒酶的提取 ⑴ 手术后取下的活组织，立即保存在液氮之中。 ⑵ 40～100mg 冷冻(-70%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，研磨器研磨，加入40 ul Lysis buffer(使用前每ml Lysis buffer 加入2μlβ-巯基乙醇);或1～2×106 沉淀细胞直接加入40μl 预冷的Lysis buffer，悬浮细胞，涡旋振荡10s, 置冰浴中30min，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次。 备注：为了获取比较理想的端粒酶提取液，建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。 ⑶ 4℃离心(13000rpm,20min)。 ⑷ 移取上清，分装3-4 管，每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。 2、 PCR 扩增(1×25ul) Ⅰ液(μl) Ⅱ液(μl) ddH2O 7.5 5.5 10×buffer 0.5 2 dNTPs 0.5 2.5 Primer1 0.5 2.5 Primer 2 0 0.5 Taq-DNA polymerase 0 0.3 内标准模板 1 1 Primer 3 2 2 3、 PCR 扩增： ⑴ 每管加入Ⅰ液9μl 及端粒酶提取液1μl，混匀，30℃反应30min。 ⑵ 上述各管93℃加热1min 灭活。 ⑶ 向上述各管中加入预热至93℃的Ⅱ液各13ul，混匀，进行第一步扩增。扩增 条件如下： 第一步： 步骤 时间 温度 预变性 3m 93℃ 变性 35s 93℃ 退火 35s 42℃ 延伸 90s 72℃ 循环数 5 延伸 60s 72℃ ⑷ 在第一步扩增最后一个循环的延伸一步的最后几秒，暂停仪器运行，快速向各管中加入primer3 2ul 和内标准模板1ul。继续运行仪器，进行第二步扩增。扩增条件如下： 第二步(连接第一步)： 步骤 时间 温度 预变性 60s 93℃ 变性 40s 93℃ 退火 40s 60℃ 延伸 50s 72℃ 循环数 36 延伸 8m 72℃ 4、 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(所有溶液，用户自备) ⑴ 制备10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(20ml)。 ddH2O 11.19 ml 36%Acr-1%Bis 5.46 ml 5%TEMED 0.4 ml 10×电泳缓冲液 2 ml 1.25% APS 1 ml ⑵ 取10ul PCR 产物与2ul 上样缓冲液混合后加样，用0.5×电泳缓冲液作为电极缓冲液，180V 电泳2h。 ⑶ 小心剥离凝胶，并置于50%甲醇、10%醋酸中，固定过夜。 备注：① 10×电泳缓冲液：15g Tris 、14g 硼酸和1.17g EDTA (不带2Na) ，用ddH2O 定容至200ml。 ② 10×上样缓冲液：0.01%溴酚兰、40%甘油、62.5mM Tris-HCl(pH 6.7) 5、银染(所有溶液，用户自备) ⑴ 将凝胶置于10%醋酸固定30min 后用蒸馏水漂洗3 次，每次5min; ⑵ 将凝胶置于0.2g/L 硫代硫酸钠浸泡1min, 然后用蒸馏水漂洗3 次，每次30s; ⑶ 将凝胶置于硝酸银染液中浸泡30min, 然后用蒸馏水漂洗30s; ⑷ 将凝胶置于显影液中显色10min 左右直到全部条带显色清晰为止; ⑸ 将凝胶置于5%醋酸中浸泡终止反应。 ⑹ 选择适当时机照相。 备注： ① 硝酸银染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至100ml。 ② 显色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸钠，定容至100ml。 6、使用凝胶分析软件进行结果分析 |
2楼2017-07-18 21:37:04
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