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1楼2017-07-15 19:20:07

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-15 23:29:24

那是引物二聚体和非特异带之类的东西吧。。。如果是我的话就把退火温度调高一点或者换一个引物，cg太高并且扎堆啦。。。

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2楼2017-07-15 19:45:15

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younglinlin

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3楼2017-07-16 16:10:19

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-08-06 12:10:24

引用回帖:

3楼: Originally posted by younglinlin at 2017-07-16 16:10:19
我也想是非特异性条带，可是不理解为嘛延伸时间是三分半，还会出现这种大小条带。啥叫cg值太高扎堆了呢？...

引物gc含量一般40—50％左右比较好，引物21碱基就是cg加起来八个或者九个是最好的。同时cg最好还能分散开，因为这俩的配对不是比at多个氢键么，更加稳定。多个cg连续的话退火的时候引物二聚体不愿意分开，cg聚集的地方尤其不愿意分开，不结合模板。
引物实在不能换的话就只能提高退火温度，当然我没听说过60度以上退火的。。。

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4楼2017-07-16 21:58:25

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-07-16 23:16:10

引用回帖:

你可以看看网上设计引物的一些要求（叫tips更合适），也有工具可以给引物评分什么的，不过不要太把工具当回事，否则会过错年的。
一般稀里糊涂的引物都可以用，最需要注意的就是cg含量，以及最好不要出现连续四个及以上的相同碱基（尤其是cg）。长点也没关系，引物长度没有必须是21，一般是因为加上保护碱基和酶切位点之后一共合成31bp，不少合成公司合成32bp以上就要加钱。。。你这好像不用连载体，再说加钱就加呗，实验做出来最重要不是么。。。

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5楼2017-07-16 22:10:10

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