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younglinlin

禁虫 (小有名气)
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1楼 2017-07-15 19:20:07
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梦幻在玩

铜虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-15 23:29:24
那是引物二聚体和非特异带之类的东西吧。。。如果是我的话就把退火温度调高一点或者换一个引物，cg太高并且扎堆啦。。。

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2楼2017-07-15 19:45:15
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younglinlin

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
3楼2017-07-16 16:10:19
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梦幻在玩

铜虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-08-06 12:10:24
引用回帖:
3楼: Originally posted by younglinlin at 2017-07-16 16:10:19
我也想是非特异性条带，可是不理解为嘛延伸时间是三分半，还会出现这种大小条带。啥叫cg值太高扎堆了呢？...

引物gc含量一般40—50％左右比较好，引物21碱基就是cg加起来八个或者九个是最好的。同时cg最好还能分散开，因为这俩的配对不是比at多个氢键么，更加稳定。多个cg连续的话退火的时候引物二聚体不愿意分开，cg聚集的地方尤其不愿意分开，不结合模板。
引物实在不能换的话就只能提高退火温度，当然我没听说过60度以上退火的。。。

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4楼2017-07-16 21:58:25
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梦幻在玩

铜虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-07-16 23:16:10
引用回帖:
3楼: Originally posted by younglinlin at 2017-07-16 16:10:19
我也想是非特异性条带，可是不理解为嘛延伸时间是三分半，还会出现这种大小条带。啥叫cg值太高扎堆了呢？...

你可以看看网上设计引物的一些要求（叫tips更合适），也有工具可以给引物评分什么的，不过不要太把工具当回事，否则会过错年的。
一般稀里糊涂的引物都可以用，最需要注意的就是cg含量，以及最好不要出现连续四个及以上的相同碱基（尤其是cg）。长点也没关系，引物长度没有必须是21，一般是因为加上保护碱基和酶切位点之后一共合成31bp，不少合成公司合成32bp以上就要加钱。。。你这好像不用连载体，再说加钱就加呗，实验做出来最重要不是么。。。

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5楼2017-07-16 22:10:10
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PattyGao

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我出现过这种问题，像这种gc含量这么高，使用primerstar 两步法来扩，不需要去考虑退火温度，直接68度搞定，
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6楼2017-07-17 14:20:07
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18829282158

新虫 (初入文坛)
可以尝试加一下DMSO

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7楼2017-08-06 12:03:57
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linminchia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 梦幻在玩 at 2017-07-15 19:45:15
那是引物二聚体和非特异带之类的东西吧。。。如果是我的话就把退火温度调高一点或者换一个引物，cg太高并且扎堆啦。。。

扎堆？

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8楼2017-08-06 15:18:33
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fankai0401

新虫 (正式写手)
引物二聚体吧

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9楼2017-10-30 00:59:19
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
PCR扩增时加上GZL PCR enhancer，或者加普通的GC buffer也行

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
10楼2017-12-20 23:54:55
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