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求助前辈们，用外周血提取蛋白 已有1人参与
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平时都是用RIPA+PMSF提取细胞的蛋白，请问前辈们用外周血提取蛋白同细胞吗？如果不同，怎么提呢？谢谢！急求 发自小木虫Android客户端 |
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晋鹏
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【答案】应助回帖
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1、可以。 2、蛋白提取与对应的提蛋白试剂： Whole Cell ( NP-40 or RIPA) Cytoplasmic (soluble) (Tris-HCl) Cytoplasmic (cytoskeletal bound) (Tris-Triton) Membrane bound (NP-40 or RIPA) Nuclear (RIPA or use nuclear fraction protocol*) Mitochondria ( RIPA or use mitochondrial fraction protocol) 3、细胞分部分离一般的实验设计是将细胞分离为细胞质的、核的、细胞膜/细胞骨架这几个部分。简单来说就是， 1. 用一端包有橡皮的玻璃棒从冷却的50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, measured pH 7.5, plus inhibitors 中收获细胞，用21号针使传代细胞破裂。 2. 通过离心（ 1000 ×g for 3 min ）收集细胞核，用1% SDS-lysis buffer溶解。 3. 所得上清液再离心（21,460 ×g for 1 h at 4 °C ）得到的片状沉淀物为细胞膜/细胞骨架，上清中的蛋白为细胞质部分的。 4. 片状的细胞膜/细胞骨架沉淀用1% SDS-lysis buffer全部重悬。另外，用TritonX-100-buffer (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)处理细胞膜，将膜被分为可溶和不可溶两部分，通过离心（21,460 ×g for 60 min ）取沉淀，用SDS-buffer将细胞骨架相连的膜重悬。 4、PMSF一定要现用现加的.因为PMSF在水液体溶液中不稳定,30分钟就会降解一半,必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF,样品处理超过1h,补加一次.长期储存需要放在-20度。 |
2楼2017-07-15 14:59:19
