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RACE通用引物已有1人参与
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想请教一下race的3，5两个通用引物是怎么设的，可以拿别人的来用吗？设上下游引物要参考通用引物的Tm值吗？最近做race有点头疼 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2017-07-09 00:35:17
晋鹏
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1、SMARTTM 3'-RACE的原理 利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer,GSP）作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer,UPM）作为下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR循环,把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来. SMARTTM 5'-RACE的原理 先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点,以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下,反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性,在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个（dC）残基,退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后,转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见Figure 2 ）.然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer,UPM）作为上游引物,用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer,GSP）作为下游引物,以SMART第一链cDNA为模板,进行PCR循环,把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来.最终,从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA,或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列,合成相应引物扩增出全长cDNA. 2、UPM,NUP是两个通用引物。序列分别 Upm: CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（长） CTAATACGAC TCACTATAGGGC（短） NUP 5’-AAGCAGTGGT AACAACGCAGAGT-3’ |
3楼2017-07-11 08:44:52
4楼2017-09-14 20:07:22