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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr产物加A尾
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吴美儒

新虫 (小有名气)
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pcr产物加A尾
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请问pcr产物回收后，加dntp,buffuer,酶，产物后用95℃孵育5分钟后在用72℃孵育30分钟的产物可以用吗？

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1楼 2017-07-08 17:56:11
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sheng_1210

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
73楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-13 11:27:37
是回收以后连接的，体系在问题中说了，菌落pcr的时候只有载体自连的条带
...

嗯，我一般是用高保真酶p出来之后胶回收40微左右，然后做一个50微体系的加尾，buffer5微dntp5微，酶1微，回收的产物39微，72度半小时，然后进行产物回收，回收成20微，再连接t载体

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74楼2017-07-13 11:30:51
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吴美儒

新虫 (小有名气)
竟然全是拿金币的

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39楼2017-07-08 18:09:23
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只想对你说

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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39楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-08 18:09:23
竟然全是拿金币的

为什么回收产物又加了后面几步，是什么意思

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47楼2017-07-08 18:12:26
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zinc650

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
72℃延伸15分钟就会加polyA啊，不知道什么叫可以用嘛，我们一般测序前会特意加

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吴美儒
54楼2017-07-08 18:33:07
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吴美儒

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
54楼: Originally posted by zinc650 at 2017-07-08 18:33:07
72℃延伸15分钟就会加polyA啊，不知道什么叫可以用嘛，我们一般测序前会特意加

我是先用高保真的酶扩增出目的条带后，然后切胶回收，在用1微升的dNTP,1uL  Buffer,2uL的水，5uL的回收产物，1uL的taq酶，在72℃孵育20分钟加A尾！
连接转化以后做菌落pcr，所有的都没有目的条带，是为啥呀？
pcr产物加A尾


pcr产物加A尾-1



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68楼2017-07-11 19:38:33
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jcstone1027

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个应该不行，不用95度变性，直接72度30分钟，最好用dATP，这个体系个人感觉得到50微升，并且一定要纯化后才能做连接，这样才可能连上去。
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69楼2017-07-12 09:16:39
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sheng_1210

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接72度30分钟就可以了，不需要变性

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70楼2017-07-13 10:10:05
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吴美儒

新虫 (小有名气)
引用回帖:
70楼: Originally posted by sheng_1210 at 2017-07-13 10:10:05
直接72度30分钟就可以了，不需要变性

直接用72℃加尾也没有成功！不知道是什么原因！

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71楼2017-07-13 11:08:54
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sheng_1210

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
71楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-13 11:08:54
直接用72℃加尾也没有成功！不知道是什么原因！
...

没成功是因为后面没有连上载体吗？加尾了之后还是需要回收的，你加尾的体系是什么样的

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72楼2017-07-13 11:12:48
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吴美儒

新虫 (小有名气)
引用回帖:
72楼: Originally posted by sheng_1210 at 2017-07-13 11:12:48
没成功是因为后面没有连上载体吗？加尾了之后还是需要回收的，你加尾的体系是什么样的
...

是回收以后连接的，体系在问题中说了，菌落pcr的时候只有载体自连的条带

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73楼2017-07-13 11:27:37
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吴美儒

新虫 (小有名气)
引用回帖:
74楼: Originally posted by sheng_1210 at 2017-07-13 11:30:51
嗯，我一般是用高保真酶p出来之后胶回收40微左右，然后做一个50微体系的加尾，buffer5微dntp5微，酶1微，回收的产物39微，72度半小时，然后进行产物回收，回收成20微，再连接t载体
...

我试试

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75楼2017-07-14 14:28:46
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七夕仙兰

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
75楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-14 14:28:46
我试试
...

你好！我现在也在做加A反应，在考虑用普通Taq酶直接72度还是用公司试剂盒，想请教你现在最出来了吗？用什么体系？谢谢！
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76楼2017-07-24 13:54:58
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