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吴美儒

新虫 (小有名气)


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pcr产物加A尾
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请问pcr产物回收后,加dntp,buffuer,酶,产物后用95℃孵育5分钟后在用72℃孵育30分钟的产物可以用吗?

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sheng_1210

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
73楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-13 11:27:37
是回收以后连接的,体系在问题中说了,菌落pcr的时候只有载体自连的条带
...

嗯,我一般是用高保真酶p出来之后胶回收40微左右,然后做一个50微体系的加尾,buffer5微dntp5微,酶1微,回收的产物39微,72度半小时,然后进行产物回收,回收成20微,再连接t载体

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74楼2017-07-13 11:30:51
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吴美儒

新虫 (小有名气)


39楼2017-07-08 18:09:23
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只想对你说

新虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
39楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-08 18:09:23
竟然全是拿金币的

为什么回收产物又加了后面几步,是什么意思

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47楼2017-07-08 18:12:26
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zinc650

铜虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
72℃延伸15分钟就会加polyA啊,不知道什么叫可以用嘛,我们一般测序前会特意加

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54楼2017-07-08 18:33:07
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吴美儒

新虫 (小有名气)


送红花一朵
引用回帖:
54楼: Originally posted by zinc650 at 2017-07-08 18:33:07
72℃延伸15分钟就会加polyA啊,不知道什么叫可以用嘛,我们一般测序前会特意加

我是先用高保真的酶扩增出目的条带后,然后切胶回收,在用1微升的dNTP,1uL  Buffer,2uL的水,5uL的回收产物,1uL的taq酶,在72℃孵育20分钟加A尾!
连接转化以后做菌落pcr,所有的都没有目的条带,是为啥呀?
pcr产物加A尾


pcr产物加A尾-1



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68楼2017-07-11 19:38:33
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jcstone1027

铁杆木虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这个应该不行,不用95度变性,直接72度30分钟,最好用dATP,这个体系个人感觉得到50微升,并且一定要纯化后才能做连接,这样才可能连上去。
69楼2017-07-12 09:16:39
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sheng_1210

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
直接72度30分钟就可以了,不需要变性

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70楼2017-07-13 10:10:05
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吴美儒

新虫 (小有名气)


引用回帖:
70楼: Originally posted by sheng_1210 at 2017-07-13 10:10:05
直接72度30分钟就可以了,不需要变性

直接用72℃加尾也没有成功!不知道是什么原因!

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71楼2017-07-13 11:08:54
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sheng_1210

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
71楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-13 11:08:54
直接用72℃加尾也没有成功!不知道是什么原因!
...

没成功是因为后面没有连上载体吗?加尾了之后还是需要回收的,你加尾的体系是什么样的

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72楼2017-07-13 11:12:48
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吴美儒

新虫 (小有名气)


引用回帖:
72楼: Originally posted by sheng_1210 at 2017-07-13 11:12:48
没成功是因为后面没有连上载体吗?加尾了之后还是需要回收的,你加尾的体系是什么样的
...

是回收以后连接的,体系在问题中说了,菌落pcr的时候只有载体自连的条带

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73楼2017-07-13 11:27:37
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吴美儒

新虫 (小有名气)


引用回帖:
74楼: Originally posted by sheng_1210 at 2017-07-13 11:30:51
嗯,我一般是用高保真酶p出来之后胶回收40微左右,然后做一个50微体系的加尾,buffer5微dntp5微,酶1微,回收的产物39微,72度半小时,然后进行产物回收,回收成20微,再连接t载体
...

我试试

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75楼2017-07-14 14:28:46
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七夕仙兰

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
75楼: Originally posted by 吴美儒 at 2017-07-14 14:28:46
我试试
...

你好!我现在也在做加A反应,在考虑用普通Taq酶直接72度还是用公司试剂盒,想请教你现在最出来了吗?用什么体系?谢谢!
76楼2017-07-24 13:54:58
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chuangyao2楼
2017-07-08 17:56   回复  
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鹘鸱鹞3楼
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npolebear6楼
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Lqboo8楼
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pandongzi10楼
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baijiazi12楼
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西西sm19楼
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lxb51720楼
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weixupeng22楼
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hostwei23楼
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dongmings24楼
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hhdyyong25楼
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秋思88326楼
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lbw9334楼
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ayu01738楼
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Genehu46楼
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tjs12348楼
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Cobra892950楼
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cffyau51楼
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zinc65052楼
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lanwangsen56楼
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子小sxp57楼
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yu080159楼
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kekenekobe60楼
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renlilili62楼
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mjlsb63楼
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marlyn65楼
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ygsu66楼
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43806709567楼
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