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然然家的

新虫 (初入文坛)

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[求助] 双酶切验证已有5人参与

构建了一个质粒，PCR验证可以P出来，但是双酶切验证却切不开，切下来的片段在2000bp左右，可是我的目的基因PCR出来只有700bp，原因在哪里呢

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1楼 2017-07-03 11:51:48

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collins_1

银虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1.做质粒构建，由于pcr过于灵敏，经常出现假阳性，我们在实验室，把模版当成水都能p出来目的基因，这就要求做pcr的环境和使用的东西要好
2.双酶切是最solid的结果，没有的话就重新构建吧，若切出来的片段太大，很有可能是你的酶切位点选错了，应当仔细核对引物是怎么设计的。

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坚持不懈

2楼2017-07-03 13:31:11

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collins_1

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引用回帖:

6楼: Originally posted by 然然家的 at 2017-07-03 17:45:02
切出来一个2000多的，原则上应该是700...

既然切出来了，很有可能你的酶切位点存在问题！

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坚持不懈

7楼2017-07-03 18:32:43

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然然家的

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引用回帖:

2楼: Originally posted by collins_1 at 2017-07-03 13:31:11
1.做质粒构建，由于pcr过于灵敏，经常出现假阳性，我们在实验室，把模版当成水都能p出来目的基因，这就要求做pcr的环境和使用的东西要好
2.双酶切是最solid的结果，没有的话就重新构建吧，若切出来的片段太大，很有 ...

我是先将目的基因连接在T载体上，双酶切就可以切下来，跑核酸胶位置也对，一旦换到这个载体上就双酶切切不开，

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3楼2017-07-03 14:02:21

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