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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 双酶切验证
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然然家的

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切验证 已有5人参与

构建了一个质粒，PCR验证可以P出来，但是双酶切验证却切不开，切下来的片段在2000bp左右，可是我的目的基因PCR出来只有700bp，原因在哪里呢
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1楼 2017-07-03 11:51:48
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collins_1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.做质粒构建，由于pcr过于灵敏，经常出现假阳性，我们在实验室，把模版当成水都能p出来目的基因，这就要求做pcr的环境和使用的东西要好
2.双酶切是最solid的结果，没有的话就重新构建吧，若切出来的片段太大，很有可能是你的酶切位点选错了，应当仔细核对引物是怎么设计的。
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坚持不懈
2楼2017-07-03 13:31:11
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collins_1

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 然然家的 at 2017-07-03 17:45:02
切出来一个2000多的，原则上应该是700...

既然切出来了，很有可能你的酶切位点存在问题！

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坚持不懈
7楼2017-07-03 18:32:43
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普通回帖

然然家的

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by collins_1 at 2017-07-03 13:31:11
1.做质粒构建，由于pcr过于灵敏，经常出现假阳性，我们在实验室，把模版当成水都能p出来目的基因，这就要求做pcr的环境和使用的东西要好
2.双酶切是最solid的结果，没有的话就重新构建吧，若切出来的片段太大，很有 ...

我是先将目的基因连接在T载体上，双酶切就可以切下来，跑核酸胶位置也对，一旦换到这个载体上就双酶切切不开，
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3楼2017-07-03 14:02:21
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hzau103

新虫 (正式写手)
不会有多个酶切位点吧？

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4楼2017-07-03 14:15:19
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collins_1

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 然然家的 at 2017-07-03 14:02:21
我是先将目的基因连接在T载体上，双酶切就可以切下来，跑核酸胶位置也对，一旦换到这个载体上就双酶切切不开，...

你是切不开还是切出来一个2000的片段？
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坚持不懈
5楼2017-07-03 15:08:19
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然然家的

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by collins_1 at 2017-07-03 15:08:19
你是切不开还是切出来一个2000的片段？...

切出来一个2000多的，原则上应该是700
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6楼2017-07-03 17:45:02
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
切出来2000的带和700差别还是很大的，单酶切看一下质粒大小，或者换两个酶切位点，再或者换引物验证一下，通用引物。测序更直接。
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想做一位科研好人
8楼2017-07-04 17:09:58
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cjyx123

新虫 (初入文坛)
请问楼主问题解决了吗？
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努力一把不让自己后悔
9楼2020-11-27 10:24:23
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cjyx123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

遇到楼主同样的问题
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努力一把不让自己后悔
10楼2020-11-27 10:25:50
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