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然然家的

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切验证已有5人参与

构建了一个质粒,PCR验证可以P出来,但是双酶切验证却切不开,切下来的片段在2000bp左右,可是我的目的基因PCR出来只有700bp,原因在哪里呢
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collins_1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.做质粒构建,由于pcr过于灵敏,经常出现假阳性,我们在实验室,把模版当成水都能p出来目的基因,这就要求做pcr的环境和使用的东西要好
2.双酶切是最solid的结果,没有的话就重新构建吧,若切出来的片段太大,很有可能是你的酶切位点选错了,应当仔细核对引物是怎么设计的。
坚持不懈
2楼2017-07-03 13:31:11
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collins_1

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 然然家的 at 2017-07-03 17:45:02
切出来一个2000多的,原则上应该是700...

既然切出来了,很有可能你的酶切位点存在问题!

发自小木虫Android客户端
坚持不懈
7楼2017-07-03 18:32:43
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普通回帖

然然家的

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by collins_1 at 2017-07-03 13:31:11
1.做质粒构建,由于pcr过于灵敏,经常出现假阳性,我们在实验室,把模版当成水都能p出来目的基因,这就要求做pcr的环境和使用的东西要好
2.双酶切是最solid的结果,没有的话就重新构建吧,若切出来的片段太大,很有 ...

我是先将目的基因连接在T载体上,双酶切就可以切下来,跑核酸胶位置也对,一旦换到这个载体上就双酶切切不开,
3楼2017-07-03 14:02:21
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hzau103

新虫 (正式写手)

不会有多个酶切位点吧?

发自小木虫Android客户端
4楼2017-07-03 14:15:19
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collins_1

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 然然家的 at 2017-07-03 14:02:21
我是先将目的基因连接在T载体上,双酶切就可以切下来,跑核酸胶位置也对,一旦换到这个载体上就双酶切切不开,...

你是切不开还是切出来一个2000的片段?
坚持不懈
5楼2017-07-03 15:08:19
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然然家的

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by collins_1 at 2017-07-03 15:08:19
你是切不开还是切出来一个2000的片段?...

切出来一个2000多的,原则上应该是700
6楼2017-07-03 17:45:02
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
切出来2000的带和700差别还是很大的,单酶切看一下质粒大小,或者换两个酶切位点,再或者换引物验证一下,通用引物。测序更直接。
想做一位科研好人
8楼2017-07-04 17:09:58
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cjyx123

新虫 (初入文坛)

请问楼主问题解决了吗?
努力一把不让自己后悔
9楼2020-11-27 10:24:23
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cjyx123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

遇到楼主同样的问题
努力一把不让自己后悔
10楼2020-11-27 10:25:50
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