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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » crispr ptarget-grna质粒构建
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落日余晖34

木虫 (正式写手)

[交流] crispr ptarget-grna质粒构建 已有3人参与

在构建这个pTarget-grna时，我看文献上说采用含grna的引物反pTargetF质粒后会产生一个缺口，修复这个缺口需要转入DH5α中，修复完成的的ptargetF-grna，构建完成是直接跑胶与ptargetF进行对比，可是就算是构建完成，也就多了20bp的样子，这个跑胶应该是分辨不出来的吧？还是说应该送去测序看一下？另外反p的时候引物应该用保真性高的聚合酶吧？
注:采用的系统是双质粒系统，在大肠中进行敲除。
有比较了解的小伙伴吗？

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有时候总要努力下
1楼 2017-07-01 11:45:40
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donkey2017

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
自然得用高保真的酶，构建好后测个序就好了
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2楼2017-07-02 10:05:40
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落日余晖34

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by donkey2017 at 2017-07-02 10:05:40
自然得用高保真的酶，构建好后测个序就好了

嗯，可以呢，我试试。

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有时候总要努力下
3楼2017-07-03 20:45:04
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POCO123

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问你pTarget-grna构建的顺利吗？我转了很多次，板子上都不长菌

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4楼2018-10-30 11:02:11
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落日余晖34

木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by POCO123 at 2018-10-30 11:02:11
请问你pTarget-grna构建的顺利吗？我转了很多次，板子上都不长菌

目前没有在做了，只遇到过糊板或长的比较少，长的比较少是正常情况，表明敲掉了，糊板的话就证明没有敲掉需要更换sgrna

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有时候总要努力下
5楼2018-11-01 09:33:24
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POCO123

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 落日余晖34 at 2018-11-01 09:33:24
目前没有在做了，只遇到过糊板或长的比较少，长的比较少是正常情况，表明敲掉了，糊板的话就证明没有敲掉需要更换sgrna
...

我还没有做到敲除那一步，就是把扩增出来的pTarget转到大肠里让它成环这步好几次没长

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6楼2018-11-01 11:30:40
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落日余晖34

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by POCO123 at 2018-11-01 11:30:40
我还没有做到敲除那一步，就是把扩增出来的pTarget转到大肠里让它成环这步好几次没长
...

这个应该好做吧，我的做法是在引物上加入sgrna和酶切位点，p完之后回收，然后再酶切连接成环

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有时候总要努力下
7楼2018-11-02 07:33:17
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POCO123

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by 落日余晖34 at 2018-11-02 07:33:17
这个应该好做吧，我的做法是在引物上加入sgrna和酶切位点，p完之后回收，然后再酶切连接成环
...

我没有加酶切位点，是想通过两条引物上加的互补序列搭在一起成环的。那你的引物具体是酶切位点-与目标序列互补的N20-gRNA这样的设计吗？

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8楼2018-11-02 15:17:18
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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9楼2019-05-08 16:03:48
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