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拉尔维奇

新虫 (初入文坛)

[求助] 老师好 最近在做无缝克隆把一个基因用fusion方法连接... 已有1人参与

老师好   最近在做无缝克隆把一个基因用fusion方法连接   却怎么也连不上去PCR产物测序是对的载体连其它基因也都可以,PCR产物与载体的摩尔比2比1基因2000bp 载体8000   是不是酶切位点的问题   今天已经重新设计引物了    还有没有可能有些基因连上去会杀死细胞,感受态用的是DH5@      stbl3也用过 @youlinglyw

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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a13515517892

木虫 (小有名气)

你克隆引物设计的时候有同源重组壁吗

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3楼2017-06-05 22:57:19
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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引用回帖:
2楼: Originally posted by 拉尔维奇 at 2017-06-05 22:43:31
还有就是无缝克隆也会存在载体自连现象的么 youlinglyw

不会自连,除非没切开有空载的可能

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4楼2017-06-05 22:58:00
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MulanQahar

金虫 (正式写手)

8楼2017-06-05 23:48:22
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MulanQahar

金虫 (正式写手)

先把pcr产物,克隆到topo_vector, 然后执行酶切,再克隆到vector。

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9楼2017-06-05 23:51:32
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nadia926499

木虫 (小有名气)

我一般摩尔比会做9:1,插入片段和质粒

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10楼2017-06-06 00:01:23
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普通回帖

拉尔维奇

新虫 (初入文坛)

还有就是无缝克隆也会存在载体自连现象的么 @youlinglyw

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2楼2017-06-05 22:43:31
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拉尔维奇

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by a13515517892 at 2017-06-05 22:57:19
你克隆引物设计的时候有同源重组壁吗

是   引物前15个碱基与载体重叠对吗

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

5楼2017-06-05 23:08:42
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拉尔维奇

新虫 (初入文坛)


送红花一朵
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-06 07:48:28
引用回帖:
5楼: Originally posted by 拉尔维奇 at 2017-06-05 23:08:42
是   引物前15个碱基与载体重叠对吗
...

将    构建好的质粒导入感受态后   冰上半小时 热激90秒后   冰上放2分钟   加了lb无抗培养基 摇一个多小时的没有摇半小时长得多是不是死掉了  ,不是同一天做的,但是对比多个板   结果就是这样

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6楼2017-06-05 23:17:50
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拉尔维奇

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by a13515517892 at 2017-06-05 22:58:00
不会自连,除非没切开有空载的可能
...

比如一个8000bp的载体双酶切的  ,用无缝克隆不会变成16000的么    毕竟有同源序列呀

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7楼2017-06-05 23:21:17
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