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[求助]
pull down实验不顺利，求教。
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各位虫友，最近我做pull-down实验做的非常不顺，首先是载体的选择问题上，我要表达的蛋白是一种定位在细胞膜上的蛋白，我选用了GST蛋白标签的pGEX6p-1载体表达蛋白，诱导后在上清中没有发现目的条带，或者说跟空白没区别，有个问题是连空白对照的标签也没看到，是不是我操作或者载体有问题的缘故？ 后面我选用了His标签的pET28a，pMAL-c2x，pMAL-c5x也跟pGEX6p-1结果一样，但是标签表达都没有问题，难道我的蛋白不表达吗？请问有没有大神做过这方面的，求指导一下，谢谢。 还有一个问题，我通过酵母双杂，得到了一个互作蛋白，我将这个互作蛋白转到pMAL-c5x诱导蛋白，在上清中得到了我的目的蛋白，但是通过纯化柱纯化时，老是收集不到诱导的蛋白，都在加洗脱液前就流穿出来，说明挂柱挂不上，这是为什么呢？是什么原因？第一次做，我都是按NEB说明书上操作的，用column buffer做为清洗液，column buffer+10mM麦芽糖作为洗脱液，请教各位怎么做的，求指导，在此先谢谢了。 pMAL系列载体有两个表达载体，c5x是表达细胞质蛋白，p5x是表达周质蛋白，请问是不是有可能我的膜蛋白基因问题导致在细胞质表达的载体上不表达？ |
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