| 查看: 2656 | 回复: 7 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
miRNA荧光定量pcr，跪求大神指点！ 已有1人参与
|
||
|
研究内容是实验组感染病毒后，realtime检测细胞中miRNA表达有无变化。 已经卡了三个月了，毫无进展，十分绝望。 1.最开始用人的原代T细胞和其他两种T细胞系来做，u6为内参，引物均为广州锐博生物订购的茎环引物。然而实验结果有一个很严重的问题就是u6的ct值极不稳定，甚至倾向于随病毒感染上调的趋势，无法定量其他miRNA的表达。 但找了大量文献，并且组内讨论认为"实验因素引起u6变化"的可能性微乎其微。 2.随后继续在T细胞系里验证，同时将GAPDH也作为内参，结果显示gapdh在细胞间稳定，而u6继续不稳定。 3.以上结果均在abi 7500测得，所有miRNA和u6从逆转录一步就使用特异茎环引物，逆转录的RNA模板均为2ug；罗氏Mix；u6 cDNA稀释100倍，其余cDNA稀释5倍。 4.这个月换了贴壁细胞来做，之前做过预实验结果和T细胞中一致，实验组u6的ct值都会变小；然而适逢7500热盖坏了，就去借用公用的abi stepone plus来跑realtime.可是现在的问题是换了仪器完全做不出来了？实验程序、体系都没变…前两次跑完全没有扩增曲线，跑胶也确实无扩增，今天事先做了普通pcr检测有产物才拿去做realtime,我调了调基线阈值，好歹有一些孔有数值了，但是数值非常随机毫无规律…比如我做了4个复孔，ct能达到19和38的差异…完全绝望…这到底是我的问题还是stepone和7500哪里不同… 每天都重振旗鼓调整实验找问题，但是每天都毫无结果…金币不多跪求师兄师姐们指点… 附今日的扩增曲线图… @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有178人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
4楼2017-06-04 20:05:36
2楼2017-06-04 20:03:46
3楼2017-06-04 20:05:27
5楼2017-06-05 08:41:17