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「求助」关于S9／微粒体 体外代谢求指导
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做药物的体外代谢，但是结果不对，怀疑是不是自己的过程步骤中有什么问题，望解答： s9：取肝（-80度冻存 20d）-冰面解冻--10*PBS（1:3）-匀浆（28/s 5min+2min）-离心（4度 9000g 20min）-取上清 -BCA法测定蛋白浓度得：稀释200倍时浓度为1.6mmol／L（后续所采用浓度） 孵育：CTL：10μl pbs+390μl s9 -预孵育（5min 37度）+100μl pbs SAM：10μl 黄嘌呤氧化酶（5mmol／l）+390μl s9-预孵育（5min 37度）- +100μl NADPH体系（nadp+ 2mM、G6P 57mM、G6PD 3.5u、mgcl2 50mM／溶于pbs） -37度孵育（0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、120min） -终止反应（+2ml 冰乙腈 涡旋30s） 离心-lcms测定 实验中遇到的问题：1/匀浆管是否可以带珠子直接离心？ 2/nadph反应体系配置后如何保存留待下一次使用？可以保存多久？ 3/g6pd是买的sigma250u装，是否可以用pbs稀释分装？或如何分装保存？ 4/g6pd的3.5u是指3.5u／ml吧？ 5/我在实验中所配置的nadph反应体系是乳浊液，是不是不对？ 6/PBS中是否需要放蛋白酶抑制剂 |
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