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larameme

新虫 (初入文坛)

[求助] q-PCR 已有1人参与

请教各位大神，RNA提出来以后反转录的cDNA扩不出来目的基因片段，但是基因组DNA能扩出来，这是什么原因？

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1楼 2017-05-27 11:54:55
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wusofa

金虫 (小有名气)

蛋白RNA相互作用研究

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RNA抽提失败，RNA降解，或者表达量太低都有可能
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larameme
2楼2017-05-27 13:35:11
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larameme

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
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2楼: Originally posted by wusofa at 2017-05-27 13:35:11
RNA抽提失败，RNA降解，或者表达量太低都有可能

会不会是引物的问题

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3楼2017-05-30 21:28:57
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wusofa

金虫 (小有名气)

蛋白RNA相互作用研究
引用回帖:
3楼: Originally posted by larameme at 2017-05-30 21:28:57
会不会是引物的问题
...

你不是基因组DNA能P出来吗？所以引物有问题的可能性不大
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4楼2017-05-31 08:32:23
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larameme

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by wusofa at 2017-05-31 08:32:23
你不是基因组DNA能P出来吗？所以引物有问题的可能性不大...

RNA当时提出来后跑完电泳显示较大的那两条带清晰可见，最小的那条带没有，浓度在100ng/ul左右，A260/A280为2.0。反转录成cDNA的浓度在1200-1300ng/ul之间！我觉得RNA质量和cDNA都没什么问题啊！

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5楼2017-05-31 17:52:01
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hill05

新虫 (小有名气)
可能你取的样品中，基因的表达量低。或者你的目的片段过大，对cDNA的要求更高。

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larameme
6楼2017-05-31 18:01:50
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larameme

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
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6楼: Originally posted by hill05 at 2017-05-31 18:01:50
可能你取的样品中，基因的表达量低。或者你的目的片段过大，对cDNA的要求更高。

能详细解释一下第一种可能性吗？我的目的基因片段在100-200bp之间，第二种可能性不太大

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7楼2017-05-31 18:12:34
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wusofa

金虫 (小有名气)

蛋白RNA相互作用研究
引用回帖:
7楼: Originally posted by larameme at 2017-05-31 18:12:34
能详细解释一下第一种可能性吗？我的目的基因片段在100-200bp之间，第二种可能性不太大
...

你的cDNA怎么定量的？
一般cDNA是不能定量的，因为A280定量的依据是碱基对280nM的光有吸收，逆转的时候我们加的dNTP是过量的，所以cDNA是定量不了的，除非你逆转录之后再做一部纯化。cDNA的量一般用RNA当量表示。比如你逆转的时候用的1ug RNA，就认为cDNA相当于1ug。
所以Ｐ不出来，要么就是你Ｐ的RNA表达量太低，要么就是降解了，不然就可能逆转出问题了
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8楼2017-06-01 09:41:12
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