| 查看: 1555 | 回复: 1 | ||
tomjiwen金虫 (小有名气)
|
[求助]
蛋白还原烷基化酶解后HPLC分段，为什么一直分不出该有的峰呢？求助求助求助
|
|
求助各位大神，小弟第一次做蛋白，是真菌蛋白，本想做iTRAQ方法，但因为第一次做，怕浪费试剂，就先采用很多文献里的方法操作，具体步骤如下： 1.蛋白提取，采用真菌蛋白提取试剂盒，离心取上清，BCA法测蛋白含量，SDS-PAGE蛋白提取应该没问题。 2.取200ug蛋白，TCA沉淀1小时，丙酮洗涤沉淀2小时，丙酮在洗涤沉淀过夜 3.沉淀用0.1%SDS-TEAB超声溶解，挥去丙酮，加TCEP至10mM，60度1h,加IAA至10mM,暗处反应30min，加酶4ug，37度12h,补加2ug,37度12h。 4.加10%TFA至0.5%，离心取上清。上清直接上样，或者冻干用流动相溶解后上样。 5。HPLC分段采用碱性条件，C18色谱柱，A相10mM甲酸铵水溶液，PH9，B相为A相加4倍乙腈。 上样分析，发现除了前6分钟有大的溶剂峰，中间有个固定的大峰外（空白在此处只有个很小的峰），其他时间跟空白相比只有非常少的小峰，响应值很低。 调过流动相PH为10，也一样跑不出来。 采用酸性液相条件的SCX柱分离也一样几乎没有东西。样品浓度的话，之前也做过500ug蛋白合并在一起的，但也基本相同，没有什么峰出现。 如果需要色谱图，我可以附上 以上就是我的方法与结果，请问各位大神，我到底哪里做错了呢 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有270人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
laop_530
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2560.2
- 散金: 160
- 红花: 5
- 帖子: 297
- 在线: 34.9小时
- 虫号: 4784992
- 注册: 2016-06-20
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
2楼2017-06-12 13:37:25
