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tomjiwen

金虫 (小有名气)

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[求助] 蛋白还原烷基化酶解后HPLC分段，为什么一直分不出该有的峰呢？求助求助求助

求助各位大神，小弟第一次做蛋白，是真菌蛋白，本想做iTRAQ方法，但因为第一次做，怕浪费试剂，就先采用很多文献里的方法操作，具体步骤如下：
1.蛋白提取，采用真菌蛋白提取试剂盒，离心取上清，BCA法测蛋白含量，SDS-PAGE蛋白提取应该没问题。
2.取200ug蛋白，TCA沉淀1小时，丙酮洗涤沉淀2小时，丙酮在洗涤沉淀过夜
3.沉淀用0.1%SDS-TEAB超声溶解，挥去丙酮，加TCEP至10mM，60度1h,加IAA至10mM,暗处反应30min，加酶4ug，37度12h,补加2ug,37度12h。
4.加10%TFA至0.5%，离心取上清。上清直接上样，或者冻干用流动相溶解后上样。
5。HPLC分段采用碱性条件，C18色谱柱，A相10mM甲酸铵水溶液，PH9，B相为A相加4倍乙腈。上样分析，发现除了前6分钟有大的溶剂峰，中间有个固定的大峰外（空白在此处只有个很小的峰），其他时间跟空白相比只有非常少的小峰，响应值很低。调过流动相PH为10，也一样跑不出来。

采用酸性液相条件的SCX柱分离也一样几乎没有东西。样品浓度的话，之前也做过500ug蛋白合并在一起的，但也基本相同，没有什么峰出现。
如果需要色谱图，我可以附上

以上就是我的方法与结果，请问各位大神，我到底哪里做错了呢

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