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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB内参不齐怎么办？
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小时静

新虫 (初入文坛)

[交流] WB内参不齐怎么办？ 已有4人参与

做了将2个月的WB，从第一次做我的所有条带都已经可以做出来了，而且每次的内参条带都不齐，目的蛋白也是看不出药效，不管是按BCA测蛋白浓度，还是按内参的灰度调整上样，或者是按照统一标准进行收样（六孔板细胞接种量一致，生长时间一致，收样时裂解细胞一致，加裂解液一样），我拿同一份样品，抛出来的内参和目的蛋白都不齐，趋势都不一样，请大侠指教！
1.上样前样品1000rpm/min，离心1min，取上清，每孔上样20ul，。
2，跑胶80v，跑过浓缩胶。换成100v跑至胶底上1cm。
3.转膜300mA，1,5h。
4.转膜结束TBST洗膜3次，5min每次，5%脱脂奶粉封闭1h，然后TBST洗去膜上多余的封闭液。抗体使用的是abcam公司的。
5.一抗均按1:10000稀释，附一抗4度过夜，
6.一抗孵育后，TBST洗膜3次，5min每次，同样方法附二抗。室温1小时
7.二抗孵育后，TBST洗3次，每次5min，TBS最后洗一遍。
8，配好ECL发光液，机器发光。
请教各位战友我的反应体系是否有问题，或者有别的原因影响我的内参如此不齐？

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1楼 2017-05-21 12:49:28
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momo1943

银虫 (初入文坛)
★
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什麼内参?? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3758299/
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2楼2017-05-22 13:48:38
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F翔T

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-23 07:43:11
不齐的话可以进行定量分析，然后用目的蛋白除以内参。定量好像用image plus6

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3楼2017-05-22 14:08:22
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蜗牛上的女孩

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-23 07:43:28
都不齐是怎么不齐？你的蛋白浓度多少？好不好看跟你配的胶有关系，你的体系没问题，但是我觉得转膜1.5小时有点久

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4楼2017-05-22 22:35:35
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subi_nur

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你后来怎么解决的，我现在遇到了跟你一模一样的问题，我们的实验条件都差不多，鬼知道我尝试了多久，快三四个月了，已在奔溃边缘
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5楼2018-11-09 19:13:21
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