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WB内参不齐怎么办？ 已有4人参与
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做了将2个月的WB，从第一次做我的所有条带都已经可以做出来了，而且每次的内参条带都不齐，目的蛋白也是看不出药效，不管是按BCA测蛋白浓度，还是按内参的灰度调整上样，或者是按照统一标准进行收样（六孔板细胞接种量一致，生长时间一致，收样时裂解细胞一致，加裂解液一样），我拿同一份样品，抛出来的内参和目的蛋白都不齐，趋势都不一样，请大侠指教！ 1.上样前样品1000rpm/min，离心1min，取上清，每孔上样20ul，。 2，跑胶80v，跑过浓缩胶。换成100v跑至胶底上1cm。 3.转膜300mA，1,5h。 4.转膜结束TBST洗膜3次，5min每次，5%脱脂奶粉封闭1h，然后TBST洗去膜上多余的封闭液。抗体使用的是abcam公司的。 5.一抗均按1:10000稀释，附一抗4度过夜， 6.一抗孵育后，TBST洗膜3次，5min每次，同样方法附二抗。室温1小时 7.二抗孵育后，TBST洗3次，每次5min，TBS最后洗一遍。 8，配好ECL发光液，机器发光。 请教各位战友我的反应体系是否有问题，或者有别的原因影响我的内参如此不齐？ 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2017-05-22 13:48:38
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-23 07:43:11
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-23 07:43:11
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不齐的话可以进行定量分析，然后用目的蛋白除以内参。定量好像用image plus6 发自小木虫Android客户端 |
3楼2017-05-22 14:08:22
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-23 07:43:28
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-23 07:43:28
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都不齐是怎么不齐？你的蛋白浓度多少？好不好看跟你配的胶有关系，你的体系没问题，但是我觉得转膜1.5小时有点久 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-05-22 22:35:35
5楼2018-11-09 19:13:21
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