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machao8405木虫 (正式写手)
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全长克隆，我心中的痛 已有1人参与
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| 最近在做全长克隆，一直很不顺利。模板为小麦cDNA，虽然早就听说小麦异源六倍体，克隆起来很费劲，但是真正做起来，才发现果然是这样。RNA提取质量很棒，完全没有问题。然后引物设计在5’端并没有过多选择，只能在3’端终止密码子到polyA之间选择，因此下游引物至少都是设计2-3条。于是进入了漫漫扩增之路，PCR程序用了：梯度PCR（52-60每2度一个梯度）、降落+热启动PCR、巢式PCR；试剂换了三家公司不同的试剂，其中包括高GC的试剂都用过，扩增结果让我小心脏哇凉哇凉的，要么就是啥条带都没，要么就是扩出来的比marker还marker；模板里面应该是有目的基因表达的，因为用定量引物在普通PCR上试过。现在还有啥路子可以走的？请各位大虾 不吝赐教！ |
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