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machao8405

木虫 (正式写手)

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[求助] 全长克隆，我心中的痛已有1人参与

最近在做全长克隆，一直很不顺利。模板为小麦cDNA，虽然早就听说小麦异源六倍体，克隆起来很费劲，但是真正做起来，才发现果然是这样。RNA提取质量很棒，完全没有问题。然后引物设计在5’端并没有过多选择，只能在3’端终止密码子到polyA之间选择，因此下游引物至少都是设计2-3条。于是进入了漫漫扩增之路，PCR程序用了：梯度PCR（52-60每2度一个梯度）、降落+热启动PCR、巢式PCR；试剂换了三家公司不同的试剂，其中包括高GC的试剂都用过，扩增结果让我小心脏哇凉哇凉的，要么就是啥条带都没，要么就是扩出来的比marker还marker；模板里面应该是有目的基因表达的，因为用定量引物在普通PCR上试过。现在还有啥路子可以走的？请各位大虾不吝赐教！

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1楼 2017-05-19 13:01:18

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wusofa

金虫 (小有名气)

蛋白RNA相互作用研究

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

多倍体确实不好克隆，非常同情楼主！
不知道楼主P的目的基因有多长，暂且给几个建议供参考。
1、因为目的基因有polyA，如果之前用的随机引物逆转的话，建议用oligdT逆转基因试试；
2、如果oligdT还不行就尝试用两个目的基因特意的反向引物逆转。
3、PCR体系不知道你用的那几个产家的，如果基因比较长建议用一些可以做长片段PCR的产品。
4、还不行的话建议做overlaping PCR试试。

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