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yuevis

铜虫 (小有名气)

[求助] 同源重组,目的基因与同源臂怎么连接? 已有2人参与

想用同源重组的方法将染色体上的一段基因替换掉,构建重组载体时,目的基因与同源臂相连一般采用什么方法,用酶切的话,会引入额外的酶切位点序列,用overlap PCR连接三个基因片段效率会不会很低或者突变比较多啊?各位一般采用什么方法?

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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
gibson assembly 效率挺高的
2楼2017-05-18 02:57:40
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wlkpatrick

新虫 (初入文坛)

用PCR扩的时候就把同源重组片段引入啊。

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3楼2017-05-18 07:21:02
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szp0401

木虫 (正式写手)

overlap就可以,用保真酶不会引入突变的

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5楼2017-05-18 07:50:56
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szp0401

木虫 (正式写手)

两两连效率高一些,但三个一起连也行,只是效率低,不行你再两两

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

8楼2017-05-18 13:21:15
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
无缝克隆高效快捷,引物酶切位点也无所谓,看你后续实验需要了。
想做一位科研好人
10楼2017-05-18 15:08:39
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普通回帖

yuevis

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wlkpatrick at 2017-05-18 07:21:02
用PCR扩的时候就把同源重组片段引入啊。

同源太长了吧,我看网上说,同源臂要500到1000bp?

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4楼2017-05-18 07:45:33
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781055707

木虫 (著名写手)

overlap PCR
采菊东篱下,悠然见南山。
6楼2017-05-18 07:53:58
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yuevis

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by szp0401 at 2017-05-18 07:50:56
overlap就可以,用保真酶不会引入突变的

好的,再请问,overlap一次把三个片段都连接还是两两连接,哪个效率好一点?

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7楼2017-05-18 07:54:18
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yuevis

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by szp0401 at 2017-05-18 13:21:15
两两连效率高一些,但三个一起连也行,只是效率低,不行你再两两

好的

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9楼2017-05-18 13:39:35
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