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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 同源重组，目的基因与同源臂怎么连接？
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yuevis

铜虫 (小有名气)

[求助] 同源重组，目的基因与同源臂怎么连接？ 已有2人参与

想用同源重组的方法将染色体上的一段基因替换掉，构建重组载体时，目的基因与同源臂相连一般采用什么方法，用酶切的话，会引入额外的酶切位点序列，用overlap PCR连接三个基因片段效率会不会很低或者突变比较多啊？各位一般采用什么方法？

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1楼 2017-05-17 20:08:05
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
gibson assembly 效率挺高的
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2楼2017-05-18 02:57:40
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wlkpatrick

新虫 (初入文坛)
用PCR扩的时候就把同源重组片段引入啊。

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3楼2017-05-18 07:21:02
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szp0401

木虫 (正式写手)
overlap就可以，用保真酶不会引入突变的

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5楼2017-05-18 07:50:56
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szp0401

木虫 (正式写手)
两两连效率高一些，但三个一起连也行，只是效率低，不行你再两两

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

yuevis
8楼2017-05-18 13:21:15
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
无缝克隆高效快捷，引物酶切位点也无所谓，看你后续实验需要了。
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想做一位科研好人
10楼2017-05-18 15:08:39
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普通回帖

yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wlkpatrick at 2017-05-18 07:21:02
用PCR扩的时候就把同源重组片段引入啊。

同源太长了吧，我看网上说，同源臂要500到1000bp？

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4楼2017-05-18 07:45:33
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781055707

木虫 (著名写手)
overlap PCR
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2017-05-18 07:53:58
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by szp0401 at 2017-05-18 07:50:56
overlap就可以，用保真酶不会引入突变的

好的，再请问，overlap一次把三个片段都连接还是两两连接，哪个效率好一点？

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7楼2017-05-18 07:54:18
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yuevis

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by szp0401 at 2017-05-18 13:21:15
两两连效率高一些，但三个一起连也行，只是效率低，不行你再两两

好的

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9楼2017-05-18 13:39:35
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