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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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gr0613

铁虫 (初入文坛)

[交流] 求助克隆何表达

我在做大肠杆菌的一个双调控基因的蛋白表达,用的是大肠杆菌的一个高表达的菌株的质粒(32a的,氨苄抗性),酶切以后做载体(而不是PET32a)。
双酶切验证也切开了,位置也对(1600+bp),转入BL21也表达,但是表达的分子量大约在55K左右(BSA,67Kb的下方),而它本身的分子量应该在80Kb的位置(分子量是已经加过20Kb的)。请问为什么会出现这种状况?解决办法是什么?

PS:师姐说让我重新PCR,提高退火温度(我以前的退火是55度)。请教其他办法。还有,换PET28a的载体有必要么?
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pinene3862

银虫 (正式写手)

★ ★
gr0613(金币+2,VIP+0):我也考虑到了突变的问题,而且很有可能是突变。但是如何解决呢
最先想到的是看一下密码子的偏好性。细菌里有些氨基酸密码子的tRNA很少,有可能翻译到这里时停下来。如果是这样,可以用Rosetta2这样的菌株,自身带有编码那些tRNA的基因,可以解决这个问题。

另外,也许还要测个序,没准扩增时有碱基突变,产生了终止密码子。
2楼2009-01-09 00:21:07
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小小木虫8580

金虫 (小有名气)


gr0613(金币+1,VIP+0):这我知道,关键是知道如何可以尽量减少突变率。谢谢参与
扩增的碱基突变几率蛮大的
3楼2009-01-09 15:07:38
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xiaoyur

金虫 (著名写手)


gr0613(金币+1,VIP+0):谢谢参与,我要的是解决方案
测序,酶切只是鉴定连上没
爱的反义词不是恨 而是冷漠!
4楼2009-01-09 22:58:40
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gr0613

铁虫 (初入文坛)

那要是测序的结果不对呢?如何改变试验方案?谢谢
5楼2009-01-10 01:12:06
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

再测另外的克隆
6楼2009-01-10 09:16:32
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xiaoyur

金虫 (著名写手)

★ ★
gr0613(金币+2,VIP+0):谢谢
如果测序正确,首先表达的蛋白和MARKER煮沸,变性电泳,
                     再不对,就只有换个表达菌株,ROSSETA之类的试试。
如果不正确,那就麻烦了,重新构建载体。用保真度高的TAQ酶扩增,连到T载体(推荐用TAKARA的simpleT)上,再酶切,连接到表达载体上,
爱的反义词不是恨 而是冷漠!
7楼2009-01-13 02:02:16
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