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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助克隆何表达
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gr0613

铁虫 (初入文坛)

[交流] 求助克隆何表达

我在做大肠杆菌的一个双调控基因的蛋白表达，用的是大肠杆菌的一个高表达的菌株的质粒(32a的，氨苄抗性），酶切以后做载体（而不是PET32a）。
双酶切验证也切开了，位置也对（1600+bp），转入BL21也表达，但是表达的分子量大约在55K左右（BSA，67Kb的下方），而它本身的分子量应该在80Kb的位置（分子量是已经加过20Kb的）。请问为什么会出现这种状况？解决办法是什么？

PS：师姐说让我重新PCR，提高退火温度（我以前的退火是55度）。请教其他办法。还有，换PET28a的载体有必要么？
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1楼 2009-01-08 23:44:34
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pinene3862

银虫 (正式写手)
★ ★
gr0613(金币+2,VIP+0):我也考虑到了突变的问题，而且很有可能是突变。但是如何解决呢
最先想到的是看一下密码子的偏好性。细菌里有些氨基酸密码子的tRNA很少，有可能翻译到这里时停下来。如果是这样，可以用Rosetta2这样的菌株，自身带有编码那些tRNA的基因，可以解决这个问题。

另外，也许还要测个序，没准扩增时有碱基突变，产生了终止密码子。
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2楼2009-01-09 00:21:07
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小小木虫8580

金虫 (小有名气)
★
gr0613(金币+1,VIP+0):这我知道，关键是知道如何可以尽量减少突变率。谢谢参与
扩增的碱基突变几率蛮大的
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3楼2009-01-09 15:07:38
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
★
gr0613(金币+1,VIP+0):谢谢参与，我要的是解决方案
测序,酶切只是鉴定连上没
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
4楼2009-01-09 22:58:40
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gr0613

铁虫 (初入文坛)
那要是测序的结果不对呢？如何改变试验方案？谢谢
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5楼2009-01-10 01:12:06
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
再测另外的克隆
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6楼2009-01-10 09:16:32
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
★ ★
gr0613(金币+2,VIP+0):谢谢
如果测序正确，首先表达的蛋白和MARKER煮沸，变性电泳，
                     再不对，就只有换个表达菌株，ROSSETA之类的试试。
如果不正确，那就麻烦了，重新构建载体。用保真度高的TAQ酶扩增，连到T载体（推荐用TAKARA的simpleT）上，再酶切，连接到表达载体上，
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
7楼2009-01-13 02:02:16
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