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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 胶回收连接载体失败的原因（片段5000bp，pMD19-T载体）
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xiaoding095

新虫 (初入文坛)

[求助] 胶回收连接载体失败的原因（片段5000bp，pMD19-T载体） 已有1人参与

实验中用高保真酶扩增基因组DNA片段，引物1和引物2在植物cDNA中的扩增片段为2380bp，在基因组DNA扩增片段超过5000bp，对基因组DNA扩增产物胶回收（浓度4ng/ul），连接pMD19-T载体，挑单菌落进行菌液pcr验证，只获得近3000处条带。请问如何才能连接到上述载体上，有可能失败的原因是什么？

胶回收连接载体失败的原因（片段5000bp，pMD19-T载体）
基因组DNA扩增片段.jpg


胶回收连接载体失败的原因（片段5000bp，pMD19-T载体）-1
菌液pcr检测载体连接效果.jpg
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1楼 2017-05-08 09:44:09
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这么长的一般都不好连。推荐用无缝克隆吧，效率会比较有保证，最近我做了一个3.6k的，一个4k多一点的，都是无缝克隆直接连目的在体，不需要通过T载体，很迅速。
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2楼2017-05-09 08:32:04
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