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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物直接测序得到双峰
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物直接测序得到双峰 已有3人参与

我做是海洋软体动物DNA条形码方面，序列（700bp）是通过PCR产物直接测序获得的（双向测序）。其中有不少出现双峰的情况，这样的结果我应该怎么办？求大神指导
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1楼 2017-05-07 10:16:09
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Real000Lee

新虫 (初入文坛)

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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:19:55
有图么？如果只是个别位点双峰并且双向测序都是这个结果，可能是由单核苷酸突变引起的或者是PCR扩增失真，如果大段序列都是这样，要么样品被污染有问题，要么测序有问题。

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2楼2017-05-07 10:22:10
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Real000Lee

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-08 21:08:55
引用回帖:
6楼: Originally posted by 吴晓雯 at 2017-05-07 12:45:14
我用的是全式金海洋生物提取试剂盒提取的总DNA，如果是污染问题，那么我的很多样本都出现这样的问题，难道几乎成批次的污染了？请大神帮忙

个人认为这个不太像无关序列的污染，我送过很多样品，被无关序列污染的峰图要比这个乱得多。如果双向都是在同一个位点出现这种套峰情况，我还是倾向于核苷酸突变或者也有可能是近源dna污染，可以挑单克隆试试。
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8楼2017-05-07 16:09:48
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)
PCR产物直接测序得到双峰

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3楼2017-05-07 10:44:01
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by Real000Lee at 2017-05-07 10:22:10
有图么？如果只是个别位点双峰并且双向测序都是这个结果，可能是由单核苷酸突变引起的或者是PCR扩增失真，如果大段序列都是这样，要么样品被污染有问题，要么测序有问题。
...

峰图就是这个样子吧 我是小白 也不会分析

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4楼2017-05-07 10:44:36
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apety

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:21:02
你给的峰图应该不是出现双峰的位置，应该是污染的可能性比较大。建议做连接转化挑取单克隆或者重新设计引物
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5楼2017-05-07 11:40:05
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)
我用的是全式金海洋生物提取试剂盒提取的总DNA，如果是污染问题，那么我的很多样本都出现这样的问题，难道几乎成批次的污染了？请大神帮忙

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6楼2017-05-07 12:45:14
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Real000Lee

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by 吴晓雯 at 2017-05-07 12:45:14
我用的是全式金海洋生物提取试剂盒提取的总DNA，如果是污染问题，那么我的很多样本都出现这样的问题，难道几乎成批次的污染了？请大神帮忙

同一个位点双向都是双峰么？
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7楼2017-05-07 16:04:01
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by Real000Lee at 2017-05-07 16:04:01
同一个位点双向都是双峰么？...

不是，同一位点下游双峰，上游是好的，因为我的目的片段小，若上游单序列比对是我要的目的片段，是不是只要上游就可以了啊，双峰就不管了就可以了啊

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9楼2017-05-08 19:42:35
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by Real000Lee at 2017-05-07 16:09:48
个人认为这个不太像无关序列的污染，我送过很多样品，被无关序列污染的峰图要比这个乱得多。如果双向都是在同一个位点出现这种套峰情况，我还是倾向于核苷酸突变或者也有可能是近源dna污染，可以挑单克隆试试。...

我问别人，人家说测序公司问题，让我重新做，但是这个没找到原因我不敢做啊

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10楼2017-05-08 19:43:38
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