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吴晓雯

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物直接测序得到双峰已有3人参与

我做是海洋软体动物DNA条形码方面,序列(700bp)是通过PCR产物直接测序获得的(双向测序)。其中有不少出现双峰的情况,这样的结果我应该怎么办?求大神指导
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Real000Lee

新虫 (初入文坛)

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感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:19:55
有图么?如果只是个别位点双峰并且双向测序都是这个结果,可能是由单核苷酸突变引起的或者是PCR扩增失真,如果大段序列都是这样,要么样品被污染有问题,要么测序有问题。

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2楼2017-05-07 10:22:10
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Real000Lee

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-08 21:08:55
引用回帖:
6楼: Originally posted by 吴晓雯 at 2017-05-07 12:45:14
我用的是全式金海洋生物提取试剂盒提取的总DNA,如果是污染问题,那么我的很多样本都出现这样的问题,难道几乎成批次的污染了?请大神帮忙

个人认为这个不太像无关序列的污染,我送过很多样品,被无关序列污染的峰图要比这个乱得多。如果双向都是在同一个位点出现这种套峰情况,我还是倾向于核苷酸突变或者也有可能是近源dna污染,可以挑单克隆试试。
8楼2017-05-07 16:09:48
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)

3楼2017-05-07 10:44:01
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Real000Lee at 2017-05-07 10:22:10
有图么?如果只是个别位点双峰并且双向测序都是这个结果,可能是由单核苷酸突变引起的或者是PCR扩增失真,如果大段序列都是这样,要么样品被污染有问题,要么测序有问题。
...

峰图就是这个样子吧 我是小白 也不会分析

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4楼2017-05-07 10:44:36
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apety

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:21:02
你给的峰图应该不是出现双峰的位置,应该是污染的可能性比较大。建议做连接转化挑取单克隆或者重新设计引物
5楼2017-05-07 11:40:05
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)

我用的是全式金海洋生物提取试剂盒提取的总DNA,如果是污染问题,那么我的很多样本都出现这样的问题,难道几乎成批次的污染了?请大神帮忙

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6楼2017-05-07 12:45:14
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Real000Lee

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 吴晓雯 at 2017-05-07 12:45:14
我用的是全式金海洋生物提取试剂盒提取的总DNA,如果是污染问题,那么我的很多样本都出现这样的问题,难道几乎成批次的污染了?请大神帮忙

同一个位点双向都是双峰么?
7楼2017-05-07 16:04:01
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by Real000Lee at 2017-05-07 16:04:01
同一个位点双向都是双峰么?...

不是,同一位点下游双峰,上游是好的,因为我的目的片段小,若上游单序列比对是我要的目的片段,是不是只要上游就可以了啊,双峰就不管了就可以了啊

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9楼2017-05-08 19:42:35
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吴晓雯

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Real000Lee at 2017-05-07 16:09:48
个人认为这个不太像无关序列的污染,我送过很多样品,被无关序列污染的峰图要比这个乱得多。如果双向都是在同一个位点出现这种套峰情况,我还是倾向于核苷酸突变或者也有可能是近源dna污染,可以挑单克隆试试。...

我问别人,人家说测序公司问题,让我重新做,但是这个没找到原因我不敢做啊

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10楼2017-05-08 19:43:38
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