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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全长P不出来怎么办，求指导
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 安志达天下 at 2017-05-05 23:16:55
第二对引物应该可以扩增出来，建议使用高保真酶扩增，延伸时间提高到三分钟试试

已使用takara的LA taq，延伸时间4分钟，依然只有引物二聚体，模板没有问题，是之前RACE时的反转录产物，并且做了正对照，条带清晰
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11楼2017-05-07 20:50:39
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:16:35
引用回帖:
9楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2017-05-07 15:12:24
模板没有问题，用的模板是之前做RACE的反转录产物，我稀释了用的，而且我拿别的引物做了对照，条带很亮...

BLAST没有找到别的接近全长的相似序列，除非样本来源跟参考序列一样，否则建议先从700-2300bp区间，甚至1300-2000bp区间，设计一对引物，最好是在保守区的，扩增测序，看看跟其他更接近，可能样本的跟你目前的参考序列不相似，这样选择目前的引物就不大可能从cDNA中扩增到目的序列。
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为什么
12楼2017-05-07 20:52:29
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bestzdz at 2017-05-06 10:55:29
试试这个：
F: ACACGTACGTTGTGAGTTGTGAC
R: GAAACATAAGAAATTGGGTAAAGTGTACTC

这对引物也是GC含量差异很大啊，而且对于全长来说会不会有点短，容易造成非特异扩增和错配啊
全长P不出来怎么办，求指导
引物.png
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13楼2017-05-07 20:54:32
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 547star at 2017-05-07 20:52:29
BLAST没有找到别的接近全长的相似序列，除非样本来源跟参考序列一样，否则建议先从700-2300bp区间，甚至1300-2000bp区间，设计一对引物，最好是在保守区的，扩增测序，看看跟其他更接近，可能样本的跟你目前的参考 ...

是相似的，我做的RACE，两端能比上，就部分碱基不同
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14楼2017-05-07 20:56:03
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by aaa0001984 at 2017-05-07 15:46:11
换phusion polymerase之类具有长片段扩增能力的酶，普通的taq之类没这能力。而且你的PCR体系也要注意扩增时间，别还在合成片段呢，温度就开始95度进行下一个循环了
...

其实3512bp并不算很长啊，按理说普通Taq酶都能扩增这个长度，为了防止突变，用了LA Taq，可是没有条带，而且延伸时间是充分的，4min呢
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15楼2017-05-07 20:58:17
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bigbei

新虫 (初入文坛)
这么长就不要一蹴而就，先一段一段p，之后重叠延伸pcr

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16楼2017-05-08 18:20:12
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Erlineee

新虫 (初入文坛)
我也是跑了三天了没跑出来我也换个酶试一下

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17楼2017-05-09 01:09:58
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doubledou

新虫 (初入文坛)
可以换HIFi酶试试

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18楼2017-05-09 09:20:28
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Romanticman

新虫 (正式写手)
可以分成两段克隆啊，完了后再连接起来

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19楼2017-05-09 20:58:00
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
问题已解决，换成primestar就有条带了，看来酶真的很重要，谢谢大家的帮助

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20楼2017-05-10 17:12:03
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