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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 安志达天下 at 2017-05-05 23:16:55
第二对引物应该可以扩增出来,建议使用高保真酶扩增,延伸时间提高到三分钟试试

已使用takara的LA taq,延伸时间4分钟,依然只有引物二聚体,模板没有问题,是之前RACE时的反转录产物,并且做了正对照,条带清晰
11楼2017-05-07 20:50:39
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:16:35
引用回帖:
9楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2017-05-07 15:12:24
模板没有问题,用的模板是之前做RACE的反转录产物,我稀释了用的,而且我拿别的引物做了对照,条带很亮...

BLAST没有找到别的接近全长的相似序列,除非样本来源跟参考序列一样,否则建议先从700-2300bp区间,甚至1300-2000bp区间,设计一对引物,最好是在保守区的,扩增测序,看看跟其他更接近,可能样本的跟你目前的参考序列不相似,这样选择目前的引物就不大可能从cDNA中扩增到目的序列。
为什么
12楼2017-05-07 20:52:29
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by bestzdz at 2017-05-06 10:55:29
试试这个:
F: ACACGTACGTTGTGAGTTGTGAC
R: GAAACATAAGAAATTGGGTAAAGTGTACTC

这对引物也是GC含量差异很大啊,而且对于全长来说会不会有点短,容易造成非特异扩增和错配啊
全长P不出来怎么办,求指导
引物.png

13楼2017-05-07 20:54:32
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 547star at 2017-05-07 20:52:29
BLAST没有找到别的接近全长的相似序列,除非样本来源跟参考序列一样,否则建议先从700-2300bp区间,甚至1300-2000bp区间,设计一对引物,最好是在保守区的,扩增测序,看看跟其他更接近,可能样本的跟你目前的参考 ...

是相似的,我做的RACE,两端能比上,就部分碱基不同
14楼2017-05-07 20:56:03
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by aaa0001984 at 2017-05-07 15:46:11
换phusion polymerase之类具有长片段扩增能力的酶,普通的taq之类没这能力。而且你的PCR体系也要注意扩增时间,别还在合成片段呢,温度就开始95度进行下一个循环了
...

其实3512bp并不算很长啊,按理说普通Taq酶都能扩增这个长度,为了防止突变,用了LA Taq,可是没有条带,而且延伸时间是充分的,4min呢
15楼2017-05-07 20:58:17
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bigbei

新虫 (初入文坛)

这么长就不要一蹴而就,先一段一段p,之后重叠延伸pcr

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16楼2017-05-08 18:20:12
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Erlineee

新虫 (初入文坛)

我也是跑了三天了没跑出来我也换个酶试一下

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17楼2017-05-09 01:09:58
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doubledou

新虫 (初入文坛)

18楼2017-05-09 09:20:28
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Romanticman

新虫 (正式写手)

可以分成两段克隆啊,完了后再连接起来

发自小木虫Android客户端
19楼2017-05-09 20:58:00
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

问题已解决,换成primestar就有条带了,看来酶真的很重要,谢谢大家的帮助

发自小木虫Android客户端
20楼2017-05-10 17:12:03
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